Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 2:58 min. • July 8th, 2025
Los péptidos que penetran en las células, los CPP, péptidos cortos cargados positivamente, pueden interactuar y atravesar las membranas celulares, lo que facilita la entrega de cargas impermeables a las células.
Para estudiar el potencial de permeabilización de la membrana de una prueba CPP in vitro utilizando un imitador de membrana celular, comience con una vesícula unilamelar grande, LUV, suspensión.
Los LUV comprenden una bicapa de fosfolípidos cargada con una sonda fluorescente impermeable a la membrana y el par de extinción correspondiente. Dentro de las vesículas, el extintor interactúa con la sonda fluorescente debido a su proximidad, lo que provoca la extinción de la fluorescencia.
Pipetee la suspensión de LUV en una cubeta de fluorescencia de cuarzo y diluya con tampón. Agrega una barra magnética. Transfiera a un espectrofluorómetro con agitación magnética para evitar la sedimentación LUV durante la ejecución. Determine la fluorescencia de fondo para eliminar cualquier fuga de LUV.
Agregue la concentración deseada de CPP a la suspensión de LUV a intervalos regulares.
Basados en la hidrofobicidad y la carga de los residuos de aminoácidos de los CPP, perturban la membrana lipídica de LUV, lo que lleva a la penetración y permeabilización de la membrana.
El daño de la membrana de la vesícula provoca la fuga de la sonda fluorescente y el apagador en la solución circundante, lo que aumenta su separación espacial. Como resultado, la sonda exhibe fluorescencia.
La adición adicional de solución de CPP conduce a una mayor permeabilidad de LUV y a la intensidad de la fluorescencia. Un aumento en la intensidad de la fluorescencia con la adición de CPP sugiere el potencial de permeabilización de la membrana del péptido.
Para medir la fuga de fluorescencia, diluya los LUV en 1 mililitro de HEPES Buffer 2 en una cubeta de fluorescencia de cuarzo a una concentración final de 100 micromolares y agregue un agitador magnético para facilitar la homogeneización de la solución durante el experimento.
Mida los LUV solos durante los primeros 100 segundos para evaluar la fluorescencia de fondo, antes de medir la fuga como un aumento en la intensidad de la fluorescencia tras la adición de alícuotas de solución peptídica durante los próximos 900 segundos.
Para medir la fuga de fluorescencia del 100% como control positivo, agregue 1 microlitro de Triton X-100 a los LUV para solubilizar las vesículas, lo que resulta en un desahogo completo de la sonda durante los últimos 100 segundos del análisis. Luego, use la fórmula para calcular el porcentaje de fuga en cada punto de tiempo.