Ensayo de proteínas solubles para cuantificar el contenido de proteínas solubles en tejidos vegetales

Para cuantificar el contenido de proteína soluble en un tejido vegetal, en un tubo, comience con una cantidad adecuada de tejido vegetal liofilizado molido.

Agregue hidróxido de sodio, un álcali, al tubo y sonique. El ambiente alcalino con las fuerzas mecánicas altera las células, liberando contenidos intracelulares, incluidas macromoléculas: proteínas solubles y carbohidratos. Incubar a temperaturas más altas.

En presencia de calor, los álcalis causan hidrólisis de proteínas, formando péptidos más pequeños y aumentando la solubilidad de las proteínas. Además, los carbohidratos se degradan.

Centrifugar la mezcla. Recoge el sobrenadante solubilizado que contiene proteínas. Agregue ácido clorhídrico para neutralizar el pH.

Tratar la muestra con ácido tricloroacético, TCA. El TCA interrumpe la capa de hidratación que rodea las proteínas, lo que lleva a la agregación y precipitación de proteínas.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante que contiene TCA. Lave el gránulo de proteína con acetona helada para eliminar cualquier TCA residual, que puede interferir con la estimación de proteínas solubles.

Seque la acetona al aire. Vuelva a suspender el gránulo de proteína en hidróxido de sodio. Diluir con agua desionizada. Transfiera a los pocillos de una placa de pocillos múltiples.

Agregue una solución ácida de tinte Coomassie Brilliant Blue G-250. En condiciones ácidas, el colorante se une a los residuos de aminoácidos básicos en las proteínas solubilizadas, lo que da como resultado un complejo azul-proteína-colorante.

Utilice un espectrofotómetro para medir la absorbancia del complejo proteína-colorante, proporcional al contenido de proteína soluble en el tejido vegetal.

Para comenzar, pese muestras replicadas de cada tejido en tubos de microcentrífuga marcados de 1,5 mililitros. A continuación, registre la masa precisa de cada muestra. Con una micropipeta, agregue 500 microlitros de hidróxido de sodio 0,1 molar a cada tubo. Cierre bien las tapas y sonique los tubos durante 30 minutos.

A continuación, coloque los tubos en un baño de agua caliente precalentado durante 15 minutos. Después de esto, centrifuga los tubos a 15.000 g durante 10 minutos. Pipetee el sobrenadante en nuevos tubos de microcentrífuga marcados con una nueva punta de pipeta para cada muestra.

Agregue 300 microlitros de hidróxido de sodio molar 0.1 molar al gránulo y repita la centrifugación durante 10 minutos. Después de esto, retire el sobrenadante y transfiéralo a los tubos que contienen el sobrenadante de la primera centrifugación.

Para neutralizar el pH del sobrenadante, agregue 11 microlitros de ácido clorhídrico molar 5.8. Use papel tornasol para confirmar que el pH es aproximadamente 7.

A continuación, agregue 90 microlitros de ácido tricloroacético al 100% a cada tubo. Luego, incube los tubos en hielo durante 30 minutos. Centrifugar las muestras a 13.000 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Con cuidado, use una línea de vacío y una punta de micropipeta de vidrio para eliminar el ácido tricloroacético.

Tenga mucho cuidado de no perturbar el pellet con la punta de succión.

A continuación, lave el gránulo con 100 microlitros de acetona enfriados a 20 grados centígrados negativos. Luego, deje que la acetona se evapore en una campana extractora. Disuelva el gránulo de proteína con 1 mililitro de hidróxido de sodio. Es posible que se requieran rondas adicionales de calentamiento, vórtice y sonicación.

Agregue 160 microlitros de cada solución estándar de IgG a una placa de 96 pocillos por triplicado, comenzando con la posición A1. A continuación, en un nuevo tubo de 1,5 mililitros, agregue 50 microlitros de cada solución de muestra a 950 microlitros de agua destilada. Luego, agregue 60 microlitros de cada muestra diluida a la placa de pocillos por triplicado, comenzando con la posición H1. Agregue 100 microlitros de agua destilada a todos los pozos de muestra en blanco y desconocidos.

Con una pipeta multicanal, agregue 40 microlitros de colorante proteico G-250 azul brillante de Coomassie a cada pocillo de la placa. Con una aguja, revienta las burbujas presentes en los pocillos. Después de esto, deje que la placa se incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, use un espectrofotómetro de microplacas para registrar los valores de absorbancia para cada pocillo a 595 nanómetros.