JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:34 min • July 8th, 2025
Toxoplasma gondii, un protozoo unicelular, es un parásito anaeróbico obligado, que se reproduce solo dentro de las células huésped.
Para cuantificar el crecimiento intracelular del parásito utilizando un ensayo basado en luciferasa, tome una suspensión de células del parásito que expresan luciferasa, una enzima que produce luminiscencia al reaccionar con su sustrato. Agregue la suspensión a un cultivo de fibroblastos del prepucio humano e incube durante un tiempo adecuado.
El parásito se une a los receptores de la célula huésped y se internaliza a través de un proceso endocítico, formando una vacuola parasitófora. La estructura proporciona un nicho para que el parásito se reproduzca.
Después de la infección, aspirar el medio, eliminando los parásitos no internalizados. Agregue un tampón de lisis que contenga un detergente y luciferina, un sustrato para la luciferasa. El detergente en el tampón crea poros en la membrana celular y lisa completamente las células, lo que resulta en la liberación de luciferasa.
La enzima liberada oxida las moléculas de luciferina, emitiendo luz. Mida la intensidad de la luminiscencia para determinar la actividad de la luciferasa. Usando pocillos replicados que contienen células huésped infectadas, mida la actividad de la luciferasa a intervalos predeterminados después de la infección.
Grafique la intensidad de luminiscencia normalizada frente a los intervalos de tiempo para obtener los cambios de pliegue en el crecimiento del parásito a lo largo del tiempo. Un aumento temporal de la intensidad indica una multiplicación exitosa del parásito.
Grafique los valores en una escala logarítmica para calcular la pendiente de la curva, que representa el tiempo de duplicación del parásito.
Para realizar un ensayo de crecimiento de Toxoplasma basado en luciferasa, comience aspirando cuidadosamente el medio de cultivos de microplacas de 96 pocillos presembrados previamente de fibroblastos de prepucio humano e inocule 150 microlitros de suspensión libre de parásitos en los pocillos en un formato de tres columnas y cinco filas.
Después de una incubación de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular, aspire cuidadosamente el medio de cada pocillo para eliminar los parásitos no invadidos y llene los pocillos en cada fila, excepto en la primera, con medio libre de rojo de fenol a temperatura ambiente. Luego, agregue 100 microlitros de una solución de sustrato de luciferasa de 12,5 micromolares en PBS en cada pocillo de la fila superior e incube las microplacas durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la lisis celular completa.
Al final de la incubación, mida la actividad de la luciferasa en un lector de microplacas. Cada lectura representa el número inicial de parásitos invadidos a las cuatro horas posteriores a la infección. Repita el análisis cada 24 horas durante los próximos cuatro días sin cambiar el medio.
Para calcular el cambio de pliegue normalizado del crecimiento del parásito, cada lectura se puede dividir por la lectura inicial a las cuatro horas después de la infección. El log2 del cambio de pliegue normalizado del crecimiento del parásito se puede trazar contra cada punto de tiempo y someterse a una función de regresión lineal para obtener la pendiente, que representa el tiempo de duplicación.