Ensayo de extracción de MSP1 para estudiar la eliminación de proteínas TA mal localizadas

Msp1, una ATPasa en la membrana externa mitocondrial, elimina las proteínas ancladas a la cola (TA) mal localizadas de la membrana a través de su poro central hexámero, lo que facilita su degradación.

Comprender el mecanismo de translocación, co-reconstituir proteínas TA y Msp1 en liposomas, lo que permite su integración en la bicapa lipídica.

Prepare una mezcla de reacción agregando los liposomas reconstituidos a un tampón adecuado que contenga chaperonas: proteínas citosólicas de control de calidad. Las chaperonas están marcadas con la enzima glutatión-S-transferasa o GST.

Agregue trifosfato de adenosina (ATP) a la reacción. El Msp1 se une a las moléculas de ATP y las hidroliza. Utilizando energía generada por hidrólisis, Msp1 transloca las proteínas TA unidas a la membrana a través de su poro central. Las chaperonas en la mezcla de reacción se unen al dominio transmembrana de las proteínas TA extraídas.

A continuación, cargue la mezcla de reacción en una columna de purificación por afinidad. La columna contiene una resina conjugada con glutatión reducido o GSH. La proteína GST en las chaperonas se une al GSH conjugado, su sustrato, uniendo los complejos de proteína chaperona-TA