Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 5:00 min. • July 8th, 2025
Los neurotransmisores monoamínicos, mensajeros químicos endógenos, transmiten señales a través de la sinapsis, el punto de contacto entre las neuronas. El sistema de neurotransmisores monoamínicos estrictamente regulado es esencial para la función neuronal normal.
Para evaluar el efecto de un fármaco de prueba sobre la liberación de monoaminas ex vivo, obtenga cortes de tejido cerebral de rata que contengan la región de interés en un tampón oxigenado enfriado, manteniendo la viabilidad del tejido.
Transfiera las rodajas de tejido a pocillos de una placa de pocillos múltiples, con insertos de filtro porosos conectados a un suministro de mezcla gaseosa y que comprenda líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado, aCSF, suplementado con inhibidores de la monoaminooxidasa. Incubar.
Los inhibidores se difunden en las células e inactivan las enzimas monoaminooxidasas, evitando la degradación de las monoaminas y aumentando su concentración disponible para su almacenamiento y liberación.
Transfiera los insertos que contienen tejido a pocillos que comprenden aCSF oxigenado y el fármaco de prueba. Incubar. El fármaco puede estimular el sistema de neurotransmisores monoamínicos, aumentando la concentración de monoaminas en el espacio extraneuronal, lo que lleva a su liberación del tejido cerebral a la solución.
Las monoaminas liberadas pasan a través de los insertos porosos hacia los pocillos, separándose del tejido.
Después de la incubación, retire los insertos que contienen rodajas de tejido. Recoja la solución de monoamina en un tubo que comprende un disolvente compatible con la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC. Transfiera el contenido del tubo a unidades de filtro premontadas. Centrifugar, eliminando los principales contaminantes.
Cargue el filtrado obtenido en la columna de HPLC y realice una cromatografía para determinar la concentración de monoamina, indicativa del efecto del fármaco de prueba sobre la liberación de monoaminas.
Para inducir la liberación de monoaminas, transfiera las muestras de tejido a cada pocillo de una cámara de salida de 48 pocillos hecha a medida, que contenga de 0,5 a 1 mililitro de tampón de salida por pocillo con burbujeo constante y suave, y deje que las muestras se recuperen durante 30 a 50 minutos a 37 grados Celsius.
Al final del período de equilibrio, mueva el soporte de tejido con tejido cerebral a pocillos que contengan 500 microlitros de tampón de salida oxigenado con o sin agente farmacológico, golpeando el soporte en el borde del pocillo para evitar la transferencia mínima de tampón entre pocillos, para una incubación de 20 minutos a 37 grados Celsius.
Al final de la incubación, mueva el soporte a un nuevo conjunto de pocillos que contengan 500 microlitros de tampón de salida con o sin el fármaco de interés, y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular, durante 20 minutos adicionales.
Durante la segunda incubación, transfiera la solución de los pocillos de la primera incubación a tubos de microcentrífuga que contengan 50 microlitros de ácido perclórico o fosfórico 1 N en hielo, y etiquete los tubos # 1.
Al final de la segunda incubación, mueva el soporte de tejido a pocillos vacíos con la placa en hielo y transfiera los sobrenadantes de la segunda incubación a nuevos tubos de microcentrífuga que contengan 50 microlitros de ácido perclórico o fosfórico 1 N, en hielo. Etiquete estos tubos # 2.
Cuando se hayan transferido todos los sobrenadantes, agregue 1 mililitro de tampón de disección helado a cada pocillo de tejido y use pinzas pequeñas para transferir cada muestra de tejido a un nuevo tubo de microcentrífuga. Retire el tampón de los tubos de muestra y almacene los tejidos a -80 grados Celsius. Luego, transfiera las soluciones de incubación recolectadas a tubos de filtro de microcentrífuga para centrifugación y coloque el filtrado en hielo, hasta el análisis de HPLC.