JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 2:52 min • July 8th, 2025
Las valvas de la válvula aórtica contienen una población heterogénea de células intersticiales valvulares, o VIC, distribuidas a lo largo de las capas de la matriz extracelular. Tras la estimulación, los VIC se transforman en osteoblastos, células formadoras de matriz ósea.
Los osteoblastos maduros secretan colágeno y proteínas de la matriz ósea. Estas proteínas ayudan a los osteoblastos a adherirse a la matriz. Finalmente, los iones de calcio intracelulares ingresan al medio de la matriz y, junto con los fosfatos, se depositan como nódulos mineralizados, lo que lleva a la calcificación de la válvula aórtica.
Para evaluar la concentración de calcio en las válvulas aórticas calcificadas, comience con un cultivo de VIC en una placa de seis pocillos. Deseche el medio de cultivo, agregue un medio osteogénico en el pocillo e incube.
Durante la incubación, la insulina en el medio osteogénico estimula los VIC para diferenciarse en fenotipos osteogénicos. Estos osteoblastos secretan proteínas de la matriz ósea y ácido ascórbico en el medio osteogénico que los induce a formar una matriz extracelular rica en colágeno.
Finalmente, el calcio intracelular de los osteoblastos y los fosfatos del medio forman cristales mineralizados en el medio.
Retire el medio y agregue la solución de ácido clorhídrico. Incubar para solubilizar los iones de calcio en la solución. Dispense el medio ácido que contiene calcio en el pocillo de una placa de pocillos múltiples.
Agregue un tinte sensible al calcio e incube. Las moléculas de colorante se unen a los iones de calcio en el medio ácido, formando un complejo de colorante y calcio de color púrpura.
Mida la absorbancia del complejo, que es proporcional a la concentración de calcio en la muestra.
Antes de comenzar el ensayo, limpie la campana de bioseguridad con etanol al 70% y caliente el medio DMEM a 37 grados centígrados. A continuación, siembre 100,000 células por condición en placas de 6 pocillos en DMEM completo y cultive a 37 grados Celsius.
Después de 24 horas, reemplace el medio sobrenadante con el medio calcificante e incube las células durante 7 días a 37 grados centígrados, reemplazando el medio al tercer día.
Después de 7 días, mida la concentración de calcio en una placa de 96 pocillos utilizando el reactivo Arsenazo III y registrando la absorbancia a 650 nanómetros.