JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:57 min • July 8th, 2025
En el pez cebra, las partículas finas ambientales, o PM, un contaminante del aire, causan un mal funcionamiento cardíaco inducido por el estrés oxidativo.
Para estudiar el impacto de las PM en el pez cebra, comience por exponer los embriones de pez cebra a la materia orgánica extraíble derivada de PM, EOM, que desencadena la generación de especies reactivas de oxígeno, o ROS.
ROS oxida la base de ADN guanina a 8-hidroxi-2′-desoxiguanosina o 8-OHdG y hace que la fosforilación de la histona H2AX forme γH2AX, un marcador de roturas de doble cadena de ADN.
Después de la exposición, disecciona el corazón del pez cebra y colócalo en un portaobjetos de vidrio. Trate el corazón con una solución fijadora que reticula las proteínas, estabilizando la estructura celular.
A continuación, agregue un reactivo de bloqueo para evitar sitios de unión inespecíficos. Agregue anticuerpos primarios que se dirijan a γH2AX y 8-OHdG en las células cardíacas.
A continuación, agregue dos anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia de diferentes colores que se unen específicamente a la región Fc de su respectivo anticuerpo primario. Finalmente, tiñe la muestra con DAPI, una tinción específica de ADN, que se une al surco menor de secuencias ricas en AT en el ADN para formar un complejo fluorescente.
Coloque el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia para observar las señales de la expresión de 8-OHdG y γH2AX en los corazones de los embriones de pez cebra tratados con EOM.
Una intensidad de fluorescencia significativamente alta de las células cardíacas indica daño oxidativo del ADN inducido por EOM y roturas de doble cadena.
Use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos de vidrio limpio. Agregue 50 microlitros de paraformaldehído al 4% a 1,25 microlitros de PBS para hacer una solución fijadora. Luego, coloque tres corazones disecados en un círculo de barrera hidrofóbica e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos. Lave los portaobjetos tres veces en PBST, durante 5 minutos por lavado. Agregue 50 microlitros de BSA a 1,000 microlitros de PBST para obtener una solución de BSA al 5% e incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante 1 hora para bloquear la unión de anticuerpos no específicos.
Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante 5 minutos por lavado. Diluir dos microlitros de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-hidroxi-desoxiguanosina, y dos microlitros de anticuerpo policlonal de conejo contra gamma-H2AX en 296 microlitros de PBST, para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios que funcione.
Incube las muestras de corazón con 50 microlitros de la solución de cóctel de anticuerpos primarios, en una cámara humidificada durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados centígrados.
Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante 5 minutos por lavado. Diluya 1 microlitro de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y 1 microlitro de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra cy3 en 500 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos secundarios que funcione.
Incube las muestras con los anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante 5 minutos por lavado. Agregue 20 microlitros de DAPI a las muestras para tinción nuclear e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aplique un cubreobjetos al portaobjetos y séllelo con esmalte de uñas para evitar que se seque y se mueva.
Tome imágenes de las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal fluorescente del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos utilizando el promedio de las muestras de control de DMSO y determine la significación estadística de los datos.