Ensayo de agregación PolyQ para identificar el efecto neuroprotector de un compuesto en gusanos

En algunos trastornos neurodegenerativos, la proteína asociada a la enfermedad comprende un tracto expandido de poliglutamina, polyQ, una cadena de residuos consecutivos de glutamina, y está conformada de manera aberrante. La conformación alterada desestabiliza la homeostasis de las proteínas, provocando la acumulación de proteínas y la formación de agregados tóxicos, lo que conduce a la disfunción neuronal y la muerte.

Para detectar la capacidad protectora de un compuesto de prueba para aliviar la proteotoxicidad asociada a la agregación de poliQ, obtenga una suspensión de larvas transgénicas de Caenorhabditis elegans que expresan proteínas poliQ marcadas con fluorescencia en células musculares de la pared corporal.

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga medios complementados con alimentos bacterianos. Agregue el compuesto de prueba en un conjunto de pocillos. Transfiera las larvas a la placa de pocillos múltiples. Selle la placa para evitar la deshidratación del medio y la contaminación microbiana. Incubar, permitiendo que las larvas se conviertan en adultos.

Durante el desarrollo, a medida que el nematodo envejece, las proteínas polyQ se acumulan progresivamente dentro de las células musculares y forman agregados.

Si el compuesto de prueba está presente en el medio, ingresa a las células musculares y, dependiendo de su capacidad protectora, puede ejercer un efecto de agregación anti-poliQ, suprimiendo y retrasando la agregación de poliQ.

Coseche los nematodos adultos y centrifugue. Vuelva a suspender los nematodos granulados. Transfiera a una placa de varios pocillos. Inmovilizar los nematodos con azida sódica.

Usando un dispositivo de fluorescencia de alta resolución, cuente los puntos fluorescentes, que representan agregados poliQ, por nematodo.

Un número promedio más bajo de agregados de poliQ en tratamiento que los pozos de control sugiere una mayor capacidad protectora del compuesto de prueba para aliviar la proteotoxicidad asociada a la agregación de poliQ.

Comience transfiriendo de 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematodos AM141 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 microlitros de medio S que contiene la cepa OP50 de E. coli y cinco miligramos por mililitro de astrágalo. Selle la placa con parafilm e incube a 20 grados Celsius y 120 rotaciones por minuto durante los intervalos de tiempo deseados.

Transfiera los nematodos en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y lávelos con tampón M9 tres veces por centrifugación, para eliminar las celdas OP50 restantes. Luego, vuelva a suspender los nematodos AM141 en el tampón M9.

Ahora, transfiera de 10 a 15 nematodos a cada pocillo en una placa de 384 pocillos, colocando 10 pocillos replicados para cada tratamiento, y agregue 10 microlitros de azida de sodio de 200 milimolares a cada pocillo, para paralizar los nematodos al permitir que se asienten en el fondo.

Coloque la placa en un sistema de imágenes de alto contenido para adquirir imágenes fluorescentes. Abra el software de adquisición de imágenes y configure los parámetros mencionados en el manuscrito de texto. Analice los datos de la imagen abriendo la ventana "Revisar datos de la placa" y seleccionando la "Placa de prueba" para el análisis de imágenes.

Haga doble clic en un pocillo de prueba para mostrar su imagen. Luego, seleccione "Contar núcleos" como método de análisis y haga clic en el botón "Configurar ajustes". Defina la imagen de origen del canal FITC y seleccione el "Algoritmo estándar".

Establezca los parámetros de análisis de imágenes como se describe en el manuscrito de texto y pruébelos para optimizar el método de análisis. Guarde la configuración y ejecute el análisis en todos los pocillos. Exporte los "Núcleos totales" como el número total de agregados Q40::YFP en cada pocillo.

Cuente el número de nematodos en cada pozo y calcule el número promedio de agregados Q40::YFP por nematodo en cada grupo. Luego, calcule el índice de inhibición.