Ensayo de heridas para evaluar la capacidad migratoria de mioblastos murinos en cocultivo

En respuesta a una herida, las células secretoras producen moléculas de señalización paracrina para activar los mioblastos, células musculares indiferenciadas. Los mioblastos activados migran hacia el sitio de la herida, donde proliferan, lo que hace que la herida sane.

Para evaluar la capacidad migratoria de los mioblastos in vitro, tome una placa multipocillo que contenga una monocapa confluente de mioblastos murinos. Con una punta de pipeta, raspe la monocapa para crear un parche lineal y libre de células dentro del pocillo, que simule el sitio de la herida.

Complemente cuidadosamente el pozo con el medio de crecimiento sin alterar el parche de la herida.

Tome un inserto membranoso que contenga un cultivo adherente de células de la cresta neural, o NCC (células secretoras) en un medio adecuado. Coloque el inserto dentro del pocillo, de modo que los NCC en la base estén cerca del parche de la herida. Incube el cocultivo durante la duración deseada.

Durante la incubación, los NCC liberan moléculas de señalización que se unen a los receptores específicos de los mioblastos, iniciando una cascada de señalización. Esta señalización facilita la reorganización de la actina en los mioblastos y, como resultado, estas células desarrollan proyecciones citoplasmáticas como lamellipodia y filopodia, en sus bordes. Estas proyecciones ayudan a que los mioblastos migren hacia el área herida y se repoblen gradualmente, lo que lleva a la cicatrización de heridas.

Coloque la placa bajo un microscopio y observe la cicatrización de la herida, cuyo alcance se correlaciona con la capacidad migratoria de los mioblastos en cocultivo.

Cuando las células alcancen una confluencia del 70% al 80%, retire bien el medio sobrenadante de la cámara C2C12 y lave las células una vez con PBS.

Después de retirar el PBS, comience a rascar las células pasando firmemente una punta de pipeta P10 estéril, en una sola dirección para abarcar toda la longitud o anchura de la monocapa celular. Una vez que las celdas estén rayadas, agregue rápidamente 1 mililitro de PBS.

A continuación, encienda la computadora y el microscopio. Coloque la diapositiva de la cámara en la platina y gire el dial del objetivo a un aumento de 5X. Abra el software de imágenes, haga clic en la pestaña "Cámara" y luego haga clic en el botón "En vivo" para visualizar las celdas en la pestaña "AxioCam IC".

Asegúrese de que el filtro de luz esté completamente extendido para permitir que la luz pase a la cámara y a la pantalla del ordenador. Mueva o gire manualmente la corredera de la cámara para colocar el área de la bobina en el centro de la imagen en vivo en la pestaña "AxioCam IC". Para tomar imágenes, haga clic en "Ajustar" para abrir una pestaña "Nuevo" junto a la pestaña "AxioCam IC" que contiene la imagen.

Para guardar esta imagen fija, haga clic en "Archivo", seleccione "Guardar como", seleccione "Escritorio" en la barra de la izquierda para guardar el archivo en el escritorio. Ingrese el "Nombre del archivo" en el cuadro de nombre del archivo y guarde la figura en formato de archivo ".czi".

Para guardar la imagen como ".tiff", haga clic en "Archivo", seleccione "Guardar como", ingrese el "Nombre de archivo" en el cuadro de nombre de archivo, haga clic en el botón "Guardar como tipo" y seleccione "*.tiff" en el menú desplegable.

Vuelva a colocar manualmente el portaobjetos de la cámara para tomar dos o tres imágenes más en otros puntos de la herida en el mismo pocillo. Después de la obtención de imágenes, retire el PBS de cada pocillo y agregue 1 mililitro de medio C2C12.

Ensamble el sistema de cocultivo de insertos de pocillos colocando manualmente los insertos que contienen las células O9-1 en cada pocillo del pocillo de la cámara. Empuje suavemente los insertos hacia abajo en el pozo de modo que la parte inferior del inserto se encuentre justo encima de las celdas C2C12 subyacentes. Devuelva las construcciones de inserción de pocillos a la incubadora y permita que las células migren durante un total de 9 a 12 horas.

Para determinar el tiempo de migración óptimo, revise las células a las seis horas posteriores a la creación de la herida, luego, cada dos o tres horas después de eso. Termine el experimento cuando las células en condiciones de control cubran completamente la herida.