Ensayo Comet para la detección de daños en el ADN en células

La exposición a agentes nocivos induce roturas monocatenarias y bicatenarias en el ADN celular, lo que conduce a daños en el ADN.

Para detectar daños en el ADN, comience con una suspensión unicelular de células tratadas químicamente en agarosa licuada de bajo punto de fusión. Cargue la suspensión en un portaobjetos de vidrio y deje que la agarosa se solidifique, lo que permite la inmovilización de las células dentro de la matriz de gel poroso.

Trate las células con tampón de lisis. Los detergentes en el tampón solubilizan las membranas celulares y nucleares, mientras que las sales eliminan las histonas del ADN, formando un cuerpo nucleoide que contiene ADN unido a la matriz nuclear.

Incube los portaobjetos en un tampón de electroforesis alcalina. Esto hace que el ADN se desenrolle y genere fragmentos monocatenarios. Coloque el portaobjetos en un aparato de electroforesis y conéctelo a la fuente de alimentación. Esto permite la migración de ADN cargado negativamente hacia el ánodo positivo.

El ADN no dañado permanece restringido dentro del cuerpo nucleoide. Por el contrario, los fragmentos de ADN más pequeños y dañados comienzan a moverse hacia el ánodo. Este movimiento diferencial forma una estructura similar a la de un cometa, en la que el ADN no dañado forma la cabeza, mientras que el ADN dañado forma la cola del cometa.

Incube el portaobjetos en un tampón de neutralización para permitir que los fragmentos de ADN monocatenario se renaturalicen. A continuación, trate el portaobjetos con un tinte fluorescente que tiñe el ADN. Visualice el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia.

La intensidad y la longitud de la cola se correlacionan con el grado de daño del ADN celular.

Para comenzar, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% en PBS y colóquela en un baño de agua a 37 grados centígrados. Etiquetó el extremo esmerilado de los portaobjetos prerrecubiertos con el nombre, la fecha y la información del tratamiento con un marcador permanente o un lápiz.

Coloque una placa de enfriamiento en un banco plano e inserte dos paquetes de enfriamiento congelados en el cajón deslizante debajo de la superficie metálica. Luego, coloque los portaobjetos en la placa de enfriamiento para enfriar previamente durante 1 a 2 minutos. Centrifugar y retirar el sobrenadante de los tubos de muestra, y volver a colocarlos inmediatamente en hielo. Vuelva a suspender el sedimento celular con 200 microlitros de agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% y mezcle mediante pipeteo.

A continuación, agregue 80 microlitros de células que contienen agarosa en un portaobjetos enfriado y coloque rápidamente un cubreobjetos en el gel. Deje que el gel se asiente en la placa de enfriamiento durante 1 a 2 minutos. Mientras tanto, prepare 500 mililitros de solución de trabajo de tampón de lisis y viértalo en la placa de lisis.

Una vez que los geles se hayan fraguado, retire los cubreobjetos rápidamente sosteniendo suavemente el cubreobjetos entre el pulgar y el índice, y deslizando el cubreobjetos fuera del gel. Luego, coloque las diapositivas dentro de un portadiapositivas, con todas las marcas de puntos negros en las diapositivas mirando en la misma dirección. Coloque el portaobjetos dentro de la placa de lisis. Cierre la tapa de la placa de lisis y póngala para incubación.

Retire con cuidado el portaobjetos de la placa de lisis sin alterar los geles. Con cuidado, coloque el portaobjetos en un plato de lavado precargado con agua helada de doble destilación. Asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas y deje la configuración durante 30 minutos.

Coloque un paquete de enfriamiento congelado debajo del tanque de electroforesis para mantener una temperatura óptima del amortiguador. Luego, agregue una solución de trabajo de electroforesis helada al tanque y transfiera el portaobjetos a él. Oriente los portaobjetos, de modo que la celda que contiene los geles apunte hacia el cátodo.

Incube los portaobjetos en el tanque de electroforesis durante 20 minutos, para permitir que el ADN se desenrolle. Luego, encienda la fuente de alimentación para realizar la electroforesis durante 20 minutos a 1,19 voltios por centímetro. Una vez completada la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire el portaobjetos del tanque de electroforesis. Deje que el portaobjetos se escurra sobre papel de seda durante 30 segundos.

A continuación, coloque el portaobjetos en un plato que contenga tampón de neutralización y déjelo durante 20 minutos. Después de esto, colóquelo en un plato de lavado que contenga agua helada doblemente destilada y déjelo durante 20 minutos. Después del lavado, retire el portaportaobjetos del agua y deje que los portaobjetos se sequen en una incubadora a 37 grados centígrados durante 1 hora.

Para rehidratar los portaobjetos, transfiera el portaportaobjetos a un plato de lavado que contenga agua helada doble destilada y déjelo durante 30 minutos. Luego, coloque el portaobjetos en un plato de tinción que contenga 2.5 microgramos por mililitro de solución de yoduro de propidio.

Cierre la tapa del plato de tinción e incube durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la incubación, transfiera el portaobjetos a un plato separado y lávelo con agua helada de doble destilación durante 20 minutos.

Retire el portaobjetos del plato y séquelo completamente en la oscuridad, ya sea en una incubadora a 37 grados Celsius o a temperatura ambiente. Después de que los portaobjetos se sequen por completo, guárdelos en una caja de portaobjetos en la oscuridad hasta que estén listos para el análisis de imágenes.