JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:04 min • July 8th, 2025
Los transportadores de aminoácidos son proteínas unidas a la membrana que median la transferencia de aminoácidos a través de las membranas celulares, regulando los procesos celulares vitales.
Para estudiar la absorción de aminoácidos in vitro, tome un cultivo de células estromales derivadas de la médula ósea de ratón. Aspirar el medio de cultivo. Agregue un tampón precalentado complementado con glutamina, un aminoácido, marcado con hidrógeno radiactivo. Incubar durante el tiempo requerido.
El tampón precalentado proporciona la temperatura fisiológica y el pH adecuado necesarios para la absorción celular de glutamina. Los transportadores de glutamina consisten en dominios de transporte, responsables de la translocación del sustrato a través del cotransporte acoplado a iones de sodio, y dominios de andamio anclados a la membrana.
El dominio de transporte se une a la glutamina radiomarcada junto con los iones de sodio del tampón. Al unirse, libera las moléculas en el citoplasma. Simultáneamente, el dominio de transporte transloca iones de sodio intracelulares y aminoácidos neutros fuera de la célula, lo que da como resultado la homeostasis celular.
Lave las células con tampón helado, terminando la reacción y eliminando cualquier glutamina radiomarcada extracelular. Agrega una solución detergente. El detergente lisa las células, provocando la liberación de glutamina radiomarcada intracelular.
Centrifugar el lisado. Agregue el sobrenadante que contiene glutamina en un vial con un cóctel de centelleo y coloque el vial dentro de un mostrador de centelleo.
Las moléculas de glutamina radiomarcadas emiten partículas beta de alta energía. Los centelleadores del cóctel absorben las partículas y emiten pulsos de luz que son detectados por el contador de centelleo.
Medir la radiactividad para estimar la absorción celular de glutamina.
Para comenzar el ensayo de captación de aminoácidos, coloque placas de 5 x 104 células ST2, en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos en medio alfa-MEM suplementado con FBS, penicilina y estreptomicina. Platee pocillos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones.
A continuación, incube las células en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante dos o tres días hasta que confluyan. Después de la incubación, aspire el medio y lave las células dos veces con un mililitro de PBS a pH 7,4. Luego, aspire el PBS antes de lavar las células una vez, con un mililitro de Krebs Ringers HEPES o KRH.
Incube las células con 0,5 mililitros de KRH recién preparado que contengan cuatro microcurios por mililitro de medios de trabajo de L-[3,4-3 H]-glutamina durante cinco minutos. Después de la incubación, recoja el medio radiactivo para dispensar en el contenedor de desechos líquidos. Luego, lave las células tres veces con KRH helado para terminar la reacción.
A continuación, agregue un mililitro de dodecil sulfato de sodio al 1% a cada pocillo y triture la mezcla 10 veces para lisar y homogeneizar las células. Luego, transfiera los lisados celulares a un tubo de 1,5 mililitros y aclare el lisado centrifugando a una velocidad mínima de 10,000 g durante 10 minutos.
Transfiera el sobrenadante a un vial de centelleo, que contenga ocho mililitros de la solución de centelleo, y lea la radiactividad en recuentos por minuto usando un contador de centelleo.
A partir de las placas de células no radiactivas restantes, tripsinizar, resuspender y contar las células para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Con un hemocitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental.