¿Por qué es importante la dependencia de la lactato deshidrogenasa para la validación del objetivo?

El ensayo depende de la lactato deshidrogenasa exógena para convertir el lactato en piruvato, lo que asegura que la generación de señal no se vea afectada por enzimas endógenas en el lisado. Esta dependencia permite atribuir específicamente la señal colorimétrica a la concentración de lactato, lo que apoya una validación precisa del blanco en las vías metabólicas.

¿Cómo encaja el aislamiento del lactato como variable independiente en la secuencia de descubrimiento?

Al cuantificar los niveles de lactato en función de las condiciones experimentales, el ensayo aísla al lactato como un producto medible del flujo glucolítico, permitiendo a los investigadores vincular perturbaciones genéticas o farmacológicas con cambios en el metabolismo energético. Esto apoya el descubrimiento temprano al proporcionar un biomarcador cuantitativo y con menor riesgo de la actividad de la vía.

¿Qué permiten las mediciones cuantitativas de absorbancia a 570 nm?

Las lecturas de absorbancia a 570 nm, tras la sustracción del fondo, se utilizan para generar una curva estándar a partir de concentraciones conocidas de lactato, lo que permite la interpolación de los niveles de lactato en las muestras de prueba. Esta señal cuantitativa posibilita el análisis de respuesta frente a la dosis y la comparación entre grupos experimentales en campañas de cribado.

¿Por qué son importantes los requisitos de análisis duplicados para la colaboración multifuncional?

Realizar mediciones por duplicado para cada muestra aumenta la fiabilidad de los datos y reduce la varianza técnica, lo cual es esencial para una interpretación coherente entre equipos de biología, cribado y análisis. Esta práctica apoya la transferencia reproducible entre unidades de descubrimiento y preclínicas.

¿Qué capacidades de análisis estadístico se requieren antes de la implementación?

Los equipos deben ser capaces de generar una curva de calibración, realizar una regresión lineal e interpolar concentraciones desconocidas a partir de la curva, seguido de la corrección por el factor de dilución (por ejemplo, multiplicar por 2,25 como se indica en el protocolo). Estas capacidades garantizan una cuantificación precisa del lactato a partir de los datos brutos de absorbancia.

Ensayo colorimétrico para la cuantificación de lactato en muestras de ensayo

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas biológicas

0 vistas • 3:08 min • July 8th, 2025

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En las células vivas, en condiciones anaeróbicas, la enzima lactato deshidrogenasa convierte el piruvato, un producto final de la glucólisis, en lactato, un metabolito clave. La cantidad de lactato producido en las células refleja su estado metabólico.

Para cuantificar la concentración de lactato intracelular, comience con una muestra de prueba de lisado de células de nematodos sin proteínas. Complemente otros pocillos de una placa de pocillos múltiples con una solución de lactato de varias concentraciones conocidas.

El lisado carece de todas las enzimas proteicas, incluida la lactato deshidrogenasa endógena, lo que garantiza una cuantificación precisa del lactato.

Agregue un tampón de ensayo de lactato en cada pocillo para mantener el pH adecuado para una actividad enzimática óptima. Complemente los pocillos con una mezcla de reacción que contenga la enzima lactato deshidrogenasa, el dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD), una coenzima y una sonda colorimétrica e incube.

Durante la incubación, la lactato deshidrogenasa cataliza la oxidación del lactato celular a piruvato, con una reducción simultánea de NAD a NADH. El NADH generado reacciona con la sonda colorimétrica para producir un producto púrpura.

Mida espectroscópicamente la absorbancia de la solución púrpura para la muestra de prueba y los estándares de lactato a 570 nanómetros. Grafique los valores de absorbancia de los estándares de lactato y genere la curva de calibración.

Finalmente, compare el valor de absorbancia de la muestra con los estándares de lactato para determinar la cantidad de lactato presente en la muestra de prueba.

Para medir la concentración de lactato, utilice un kit de ensayo colorimétrico para realizar análisis duplicados de las muestras de prueba. Agregue 10 microlitros de las muestras de prueba a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y luego agregue tampón de ensayo de lactato a cada muestra para ajustar el volumen a 50 microlitros.

Diluya 100 milimolares L(+)-Lactato estándar con tampón de ensayo de lactato a 1 milimolar. Luego, en una serie de pocillos, agregue 0, 2, 4, 6, 8 y 10 microlitros de L(+)-lactato estándar diluido. Agregue 50 microlitros de mezcla de reacción en cada pocillo e incube a temperatura ambiente protegido de la luz durante al menos 30 minutos para que se desarrolle el color.

Finalmente, use un lector de microplacas para medir la absorbancia de cada pocillo a 570 nanómetros. Reste la absorbancia de la mezcla de control de fondo de la absorbancia de la mezcla de reacción. Luego, grafique la curva estándar de lactato y calcule las concentraciones de lactato a partir de la curva multiplicando cada concentración por 2,25.