Ensayo de piruvato para la estimación de los niveles de piruvato en fracciones celulares de gusanos

Los niveles celulares de piruvato, un intermediario clave en las vías bioquímicas productoras de energía, se pueden estimar mediante ensayos colorimétricos basados en enzimas.

Para determinar los niveles de piruvato en las células de Caenorhabditis elegans, un nematodo no parasitario, tome una fracción celular preparada a partir de gusanos adultos que contienen piruvato. Trate la solución, elimine las proteínas celulares y recolecte la fracción celular clarificada, la muestra de prueba, que contiene piruvato. La ausencia de proteínas celulares garantiza una determinación precisa de los niveles de piruvato.

Comience agregando un reactivo de trabajo que contenga las enzimas piruvato oxidasa y peroxidasa de rábano picante, y un colorante cromogénico. Incube la mezcla en la oscuridad durante un tiempo adecuado.

Durante la incubación, la piruvato oxidasa reacciona con el piruvato, su sustrato, generando peróxido de hidrógeno como subproducto. La ausencia de luz evita la descomposición espontánea del peróxido de hidrógeno.

La peroxidasa de rábano picante cataliza la reacción entre el peróxido de hidrógeno y el colorante cromogénico, produciendo un producto coloreado. La intensidad del producto de reacción coloreado es directamente proporcional a la concentración de piruvato en la muestra.

Una vez finalizado el período de incubación, coloque la muestra dentro de un lector de placas y mida la absorbancia. Genere una curva estándar utilizando una dilución en serie con concentraciones conocidas de piruvato.

Grafique el valor de absorbancia medido de la muestra de prueba en la curva para determinar la concentración de piruvato en la muestra de prueba.

Utilice un kit de ensayo colorimétrico para medir la concentración de piruvato en las muestras de prueba y realice exámenes dúplex.

Agregue 10 microlitros de las muestras de prueba a diferentes pocillos de una placa de 96 pocillos y agregue 90 microlitros de reactivo de trabajo a cada muestra. Incubar tapado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, coloque la placa en un lector de microplacas para medir la absorbancia de cada pocillo a 570 nanómetros.

Grafique la curva estándar de piruvato y calcule las concentraciones de piruvato a partir de la curva estándar multiplicando cada concentración por 2,25.