JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:00 min • July 8th, 2025
La glucógeno sintasa, una enzima crucial en la síntesis de glucógeno, escinde la glucosa difosfato de uridina, o glucosa UDP, un azúcar nucleótido, en UDP y residuos de glicosilo y agrega el monómero de glucosa liberado a la cadena de glucógeno en crecimiento.
Para estimar la actividad de la glucógeno sintasa, comience tomando una mezcla de reacción que contenga glucógeno, UDP-glucosa, ATP, fosfoenolpiruvato y dinucleótido de nicotinamida y adenina, o NADH, en un tubo. Agregue la enzima quinasa nucleósido difosfato o NDP y un cóctel de enzimas piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa. Mezcle el contenido e incube.
Agregue una muestra que contenga glucógeno sintasa al tubo para iniciar la reacción enzimática.
La glucógeno sintasa actúa sobre la glucosa UDP, generando UDP y un residuo de glicosilo. La enzima absorbe el monómero de glucosa libre y lo incorpora a la cadena de glucógeno de la mezcla de reacción. En presencia de ATP, la quinasa NDP de la mezcla de reacción fosforila el UDP no utilizado, convirtiéndolo en UTP y generando ADP.
La enzima piruvato quinasa actúa sobre el ADP y agrega un fosfato donado por el fosfoenolpiruvato de la mezcla de reacción para producir ATP y piruvato. A continuación, la lactato deshidrogenasa convierte el piruvato en lactato y oxida el NADH durante la reacción.
Mida la disminución de la absorbancia de NADH a 340 nm para cuantificar la cantidad de NADH consumida, lo que indica una actividad enzimática exitosa.
Para comenzar con la determinación de la actividad de la glucógeno sintasa, descongele las soluciones madre previamente preparadas de UDP-glucosa, ATP, fosfoenolpiruvato y quinasa NDP en hielo. Precalienta un baño de agua a 30 grados centígrados.
Cuando las soluciones madre estén listas, preparar suficiente mezcla de ensayo de acuerdo con el número de ensayos de glucógeno sintasa, agregando los reactivos a un tubo de 15 mililitros, como se describe en el protocolo de texto.
Prepare una reacción en blanco reemplazando el NADH de la mezcla de reacción con el agua y transfiera la reacción a una cubeta de metacrilato desechable. Utilice la reacción en blanco para establecer 'Cero' en el espectrofotómetro a la longitud de onda de 340 nanómetros.
Tome una alícuota de 770 microlitros de la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros y agregue secuencialmente 2 microlitros cada uno, de la mezcla de NDP quinasa y piruvato quinasa / lactato deshidrogenasa al tubo.
Después de mezclar suavemente, incube el tubo a 30 grados centígrados en el baño de agua, durante 3 minutos para precalentar la mezcla de reacción. A continuación, añadir 30 microlitros de la muestra que contiene glucógeno sintasa, en tampón Tris de 20 milimolares a pH 7,8, y mezclar suavemente antes de transferir la mezcla de reacción a una cubeta de metacrilato desechable.
Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nanómetros a intervalos cronometrados durante 10 a 20 minutos. Luego, grafique las absorbancias obtenidas contra el tiempo.