JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:52 min • July 8th, 2025
Para la medición continua del comportamiento de la celda mediante el análisis de celdas en tiempo real, RTCA, obtenga una placa de microtitulación RTCA que contenga matrices de microelectrodos de oro de medición de impedancia incrustadas en el fondo del pocillo. Agregue con cuidado el medio de cultivo celular a los pocillos.
Dentro del medio conductor de electricidad, aplique un potencial eléctrico débil a través de los microelectrodos. El potencial hace que la corriente eléctrica fluya entre los microelectrodos, lo que facilita la medición de la impedancia de referencia, la resistencia eléctrica inherente al medio.
Pipetee las concentraciones deseadas de suspensión de células de mamíferos en los pocillos que contienen medio. Deje que las células se distribuyan uniformemente en el pozo.
Durante la incubación, las células se adhieren al fondo del pocillo. Las células adherentes de los microelectrodos actúan como aislantes, restringiendo el flujo de corriente y aumentando la impedancia.
Gradualmente, las células proliferan en los microelectrodos, lo que lleva a un aumento de la impedancia exponencial.
Después de la formación de la capa celular confluente, las células encuentran privación de nutrientes y sufren la muerte. Como resultado, las células se desprenden de los microelectrodos, disminuyendo la impedancia.
La medición continua de la impedancia facilita el monitoreo en tiempo real de los eventos celulares, incluida la proliferación y muerte celular.
Para determinar la cantidad adecuada de células para la infección celular, prepare cultivos celulares MDCK confluentes de aproximadamente el 80% de 24 horas, como se demostró, antes de lavar las células con PBS y recolectarlas con una incubación de 45 minutos en 3 mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% por matraz a 37 grados Celsius.
Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 7 mililitros de medio de cultivo fresco por matraz y cuente las células de cada cultivo. Diluir las células a 4 x 105 células por mililitro de medio de cultivo celular y realizar diluciones en serie dobles de las células, como se indica.
Coloque una placa E a temperatura ambiente durante varios minutos, antes de agregar 100 microlitros de medio de cultivo celular a cada pocillo sin tocar los electrodos de la placa E. Desbloquee las cunas e inserte el extremo frontal de la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento de medición de impedancia. Cierre la puerta de la incubadora y abra el software.
En la "Configuración predeterminada del patrón de experimento", resalte las bases seleccionadas y haga doble clic en la página superior para ingresar el nombre del experimento. Haga clic en "Diseño" e ingrese la información de muestra necesaria para cada pocillo seleccionado de la placa. Haga clic en "Programar" | "Pasos" | y "Agregar un paso". El software agregará automáticamente un paso de 1 segundo para medir la impedancia de fondo.
Haga clic en "Ejecutar" e "Iniciar / Continuar". Haga clic en "Trazar" y "Agregar" para seleccionar los pocillos apropiados, confirmando que la impedancia de fondo está entre menos 0.1 y 0.1, antes de continuar con el siguiente paso.
A continuación, retire la placa de la cuna y agregue 100 microlitros de cada suspensión celular a los pocillos apropiados por duplicado. Deje la placa E en la campana de flujo laminar durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir una distribución uniforme de las células en el fondo de los pocillos, antes de cargar la placa E en el bolsillo de la cuna. Haga clic en "Programar" y "Agregar paso" e ingrese valores para monitorear las celdas cada 30 minutos durante 200 repeticiones antes de seleccionar "Iniciar / Continuar".
Para verificar y trazar los datos de impedancia celular, haga clic en "Trazar" y seleccione la concentración de células que se encuentra justo antes de la fase estacionaria 24 horas después de la siembra, para obtener células que aún están en una fase de crecimiento durante la infección viral.
Este artículo describe un método para la medición continua del comportamiento celular mediante análisis celular en tiempo real (RTCA). La técnica consiste en monitorear los cambios de impedancia en cultivos celulares para evaluar la proliferación y la muerte celular.
La monitorización en tiempo real de la impedancia permite la evaluación continua y sin marcadores de la dinámica celular, proporcionando información predictiva sobre la proliferación y la citotoxicidad para la validación temprana de objetivos. Este enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas al ofrecer datos cuantitativos y reproducibles que orientan las decisiones de avance o interrupción en la identificación de compuestos prometedores y en los flujos de trabajo preclínicos. El método mejora la relevancia del portafolio al reducir la ambigüedad biológica en sistemas relevantes para la enfermedad antes de aplicaciones posteriores intensivas en recursos.
La monitorización en tiempo real de la impedancia se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación preclínica, ofreciendo una resolución cinética de los eventos celulares que apoya la toma de decisiones basada en datos en cada etapa.
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Última actualización: 29 agosto 2026