JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:00 min • July 8th, 2025
Durante la infección por el virus de la influenza, el virus ingresa a la célula a través de la endocitosis y secuestra la maquinaria de la célula huésped, produciendo viriones de progenie. Estos se liberan, infectando las células vecinas, causando una cascada de infección.
Para medir la proporción de virus de la influenza infecciosa a células en cultivo (multiplicidad de infecciones), agregue una densidad adecuada de suspensión de células de mamíferos recién obtenidas en una placa de microtitulación.
La placa contiene microelectrodos de oro que miden la impedancia incrustados en el fondo del pocillo. Incubar, permitiendo que las células se adhieran al fondo del pocillo y alcancen la fase de crecimiento exponencial antes de la infección.
Aplique un pequeño potencial eléctrico entre los microelectrodos. Las células adheridas a los microelectrodos actúan como aislantes, restringiendo el flujo de corriente y aumentando la resistencia eléctrica (impedancia) que se mide.
Retire el medio. Pipetee la suspensión del virus de la influenza en los pocillos. Complemente con una serina endoproteasa adecuada.
Durante la incubación, la serina endoproteasa escinde y activa la glicoproteína viral hemaglutinina, facilitando su unión a receptores específicos de la célula huésped y la posterior entrada en células virales.
Usando maquinaria de células huésped, se producen y liberan nuevas partículas virales, infectando las células vecinas. Como resultado, las células infectadas por el virus sufren cambios morfológicos y muestran efectos citopáticos, lo que lleva a la muerte celular: las células se desprenden de la superficie del microelectrodo, disminuyendo la impedancia con el tiempo.
Determine el tiempo necesario para que la impedancia se reduzca a la mitad de la impedancia inicial antes de la adición del virus. Un marco de tiempo más corto sugiere una mayor multiplicidad de infecciones virales.
Para determinar la correlación entre los valores de CIT50 y la multiplicidad de infecciones, después de cultivar 3 x 104 células MDCK recién divididas en cada pared de la placa de microtitulación electrónica durante 24 horas, lave las células dos veces con 100 microlitros de medio de propagación de virus frescos por pocillo por lavado, y use una pipeta de un solo canal para agregar 100 microlitros de suspensión viral a cada pocillo.
Cuando se hayan agregado todas las diluciones del virus, cargue suavemente la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento a 35 grados Celsius y comience a monitorear la impedancia celular cada 15 minutos durante al menos 100 horas, como se demostró.
Después de dos ciclos de mediciones, haga clic para "Pausar" el aparato y retire la placa E de la base. Agregue 100 microlitros de medio de propagación de virus suplementado con TPCK-tripsina a cada pocillo y devuelva la placa de placa E al bolsillo de la base. Luego, comience el análisis.