Ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico para evaluar el estrés oxidativo en suero humano

Las células generan bajos niveles de radicales libres durante los procesos metabólicos.

En condiciones patológicas, se produce una sobreproducción de radicales libres, lo que provoca estrés oxidativo. Estos radicales libres atacan los ácidos grasos poliinsaturados en los fosfolípidos de la membrana celular en un proceso llamado peroxidación lipídica. Esto forma productos de oxidación tóxicos, incluidos hidroperóxidos lipídicos y malondialdehído (MDA), que causan daño a la membrana y muerte celular.

Para detectar el estrés oxidativo en suero humano in vitro utilizando el ensayo de sustancia reactiva al ácido tiobarbitúrico (TBARS), comience con un tubo que contenga suero humano tratado con un compuesto inductor de oxidación. El suero tratado comprende principalmente productos de peroxidación lipídica (MDA e hidroperóxidos lipídicos) junto con fosfolípidos, lípidos y proteínas.

A continuación, agregue dodecil sulfato de sodio (SDS) y mezcle para solubilizar los lípidos y liberar el MDA. SDS desnaturaliza cualquier proteína contaminante. Añadir un tampón ácido adecuado, seguido de ácido tiobarbitúrico ácido (TBA). Incubar a alta temperatura.

En condiciones ácidas y altas temperaturas, las moléculas de TBA reaccionan con MDA, formando un complejo estable de MDA-TBA rojo-rosa, llamado TBARS. Incubar en hielo para detener la reacción y estabilizar los complejos existentes.

centrífuga. Recoja y transfiera el sobrenadante que contiene MDA-TBA a una placa de pocillos múltiples. Usando un lector de microplacas, mida la absorbancia del complejo.

Una mayor absorbancia sugiere una alta concentración de TBARS, lo que indica niveles más altos de productos de peroxidación lipídica y estrés oxidativo en suero.

Etiquete los tubos de vidrio para las muestras a analizar, luego, agregue 100 microlitros de la muestra preparada a cada tubo. Agregue 200 microlitros de SDS al 8,1% a cada muestra y gire suavemente el tubo de vidrio con movimientos circulares para mezclar.

Agregue 1,5 mililitros de tampón de acetato de sodio 3,5 molar a cada muestra. Luego, agregue 1,5 mililitros de solución acuosa de ácido tiobarbitúrico al 0,8%. Lleve el volumen final en cada tubo a 4 mililitros agregando 700 microlitros de agua desionizada. Tape bien los tubos de vidrio e incube en un bloque calefactor a 95 grados centígrados durante 1 hora. Cubra los tubos con papel de aluminio para evitar la condensación. Luego, retire los tubos del bloque e incube en hielo durante 30 minutos.

Después de la incubación, centrifugar las muestras y los patrones a 1.500 x g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera 150 microlitros de sobrenadante de cada tubo a un pocillo en una placa de 96 pocillos, eliminando las burbujas de aire con una punta de pipeta.

Mida la absorbancia de las muestras a 532 nanómetros. Luego, reste la lectura de absorbancia promedio de las muestras en blanco de todas las demás lecturas de absorbancia.

Cree una curva estándar y utilícela para calcular concentraciones de muestra desconocidas.