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En el ojo de los mamíferos, la coroides, ubicada entre la esclerótica y la retina, contiene macrófagos perivasculares y la coriocapilar, una capa de capilares sanguíneos revestidos por pericitos que suministra oxígeno y nutrientes a la retina. La aparición anormal de vasos sanguíneos en la coriocapilar se produce en varias enfermedades oculares vasculares.
Para estudiar la germinación coriocapilar desregulada ex vivo, tome explantes de ojo de ratón recolectados que contengan la coroides unida a la esclerótica y al epitelio pigmentario de la retina, o EPR.
Agregue gotas de extracto de membrana basal, o BME, un hidrogel enriquecido en proteínas de la matriz extracelular, a los pocillos de una placa de pocillos múltiples. Coloque los explantes en la gota, evitando el aplanamiento del tejido. Permita que el BME se solidifique.
Agregue medio suplementado con células endoteliales o factores de crecimiento específicos de EC. Incubar. El EPR secreta el factor de crecimiento endotelial vascular que, junto con los factores de crecimiento específicos de la CE, estimula la proliferación de la CE capilar.
El BME solidificado forma una matriz extracelular que promueve la proliferación de CE para formar túbulos capilares que brotan. Los pericitos migran y se adhieren a estos capilares germinantes, facilitando la maduración de las CE capilares.
Los macrófagos activados en la región de germinación secretan enzimas para digerir la membrana de Bruch, la capa coroidea más interna, lo que permite que los brotes migren al EPR.
Bajo un microscopio, visualice los capilares que brotan. Con un software adecuado, mida el área cubierta por el brote coroideo.
Un área de brote coroideo más grande indica una germinación coriocapilar progresiva en el explante.
Agregue 30 microlitros del BME descongelado en el centro de cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Asegúrese de que la gota de BME forme una cúpula convexa en la parte inferior de la placa sin tocar los bordes.
Coloque el tejido en el medio del BME. No aplane el explante de coroides. Deje que el tejido se expanda dentro del BME. Incuba la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos para que el gel se solidifique. Luego, agregue 500 microlitros de medio clásico completo en cada pocillo. Cambia el medio clásico cada dos días.
La germinación de la coroides se puede observar después de tres días con un microscopio. Abra la imagen de brote de coroides con la Imagen J y marque "Imagen | Tipo | y 8 bits" con escala de grises. Luego optimice el contraste seleccionando "Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste" y ajustándolo.
Use la función "Varita mágica" para delinear y eliminar el tejido coroideo, que está presente en el centro de los brotes. Elimina el fondo de la imagen con las herramientas de selección gratuitas.
A continuación, vaya a "Imagen | Ajustar | Umbral " y use la función "Umbral" para definir los brotes microvasculares contra el fondo y la periferia. Haga clic en "F2" y aparecerá un resumen. Haga clic en "Guardar" para guardar una imagen del área seleccionada en la misma carpeta que la imagen original para referencia futura.
Después de medir un grupo de muestras, copie los datos registrados para su análisis.