Ensayo de actividad del receptor-receptor de estrógeno para detectar la actividad estrogénica de los fitoestrógenos

Los estrógenos son hormonas esteroides que actúan como moléculas de señalización endocrina y se unen a los receptores nucleares: receptores de estrógeno beta, formando complejos de receptores de estrógeno-beta.

Estos complejos ligando-receptor se dimerizan y forman homodímeros en el citoplasma celular. El homodímero resultante ingresa al núcleo, se une al elemento de respuesta al estrógeno, ERE, una secuencia de ADN específica dentro del promotor del gen diana, e inicia la transcripción.

Para determinar la actividad estrogénica de los fitoestrógenos, metabolitos secundarios derivados de plantas que imitan la función del estrógeno, comience con una placa de múltiples pocillos que contenga células reporteras suspendidas en un medio apropiado.

Las células reporteras están diseñadas para sobreexpresar los receptores de estrógeno beta y transfectadas con un gen de luciferasa fusionado con el promotor ERE. Agregue la solución de muestra que contiene fitoestrógenos e incube.

Durante la incubación, el fitoestrógeno se une a los receptores de estrógeno, beta, expresados en las células reporteras. Una vez unidos, los complejos fitoestrógeno-receptor se dimerizan y se translocan al núcleo.

Dentro del núcleo, el complejo dimerizado se une al ERE. La unión inicia la transcripción del gen de la luciferasa, produciendo la enzima luciferasa. A continuación, retire el medio y agregue un reactivo que contenga un sustrato para luciferasa. Incubar para permitir que la enzima luciferasa expresada oxide su sustrato y produzca luminiscencia.

Mida la luminiscencia, lo que confirma la actividad estrogénica del compuesto en la muestra.

Agite las muestras. Luego, agregue 4 microlitros de cada muestra a 496 microlitros de medio de detección de compuestos, para obtener una solución de DMSO al 0,8%.

Desinfecte la superficie exterior de un tubo de medio de recuperación de celdas precalentado con etanol al 70% y transfiera 10 mililitros del medio a un tubo de celdas reporteras congeladas para descongelarlas. Cierre el tubo de células indicadoras y colóquelo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 5 a 10 minutos.

Después de recuperar las células del baño de agua, invierta suavemente el tubo varias veces para romper los agregados de células y producir una suspensión homogénea. Luego, limpie la superficie del tubo con etanol al 70%.

Utilice una pipeta multicanal para dispensar 100 microlitros de la suspensión de células reporteras en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego, dispense 100 microlitros de muestras por triplicado en los pocillos apropiados. Incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 22 a 24 horas.

Justo antes del final de la incubación de la placa, retire el sustrato de detección y el tampón de detección del refrigerador y colóquelos en un área con poca luz hasta que estén equilibrados a temperatura ambiente. Luego, invierta suavemente cada tubo para mezclar las soluciones.

Inmediatamente antes de que se complete la incubación de la placa, vierta todo el contenido del tampón de detección en el tubo del sustrato de detección para crear un reactivo de detección de luciferasa. Mezcle el tubo suavemente, para que no produzca espuma.

Deseche el contenido de la placa de muestra en un contenedor de desechos apropiado y golpéelo suavemente sobre una toalla de papel absorbente limpia para eliminar las últimas gotas de los pocillos. Agregue 100 microlitros del reactivo de detección de luciferasa a cada pocillo y deje reposar la placa de ensayo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, cuantifique la luminiscencia usando un luminómetro de lectura de placas de 96 pocillos.