Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 4:00 min. • July 8th, 2025
El crecimiento de neuritas, donde las neuronas desarrollan proyecciones, es crucial para la función y regeneración neuronal.
Para evaluar los efectos neurotóxicos de los compuestos de prueba promotores del crecimiento de neuritas in vitro, obtenga una suspensión de células progenitoras neurales humanas, hNPC, en medios de diferenciación.
Siembre las células en pocillos de placas de pocillos múltiples recubiertos con poli-L-lisina y laminina, lo que facilita la unión celular al fondo del pocillo y apoya el crecimiento celular. Los componentes del medio de diferenciación promueven la diferenciación de hNPC en neuronas.
Trate un conjunto de pocillos con un compuesto de prueba que promueve el crecimiento de neuritas. Esto interactúa con las neuronas derivadas de hNPC y puede inducir el crecimiento de neuritas, sin interrumpir los procesos metabólicos celulares y la concentración posterior de trifosfato de adenosina, ATP, la principal fuente de energía celular.
Agregue el reactivo de un solo paso que contiene detergentes, enzima luciferasa y sustrato de luciferasa, luciferina e inhibidores de ATPasa junto con iones de magnesio y mezcle.
Los detergentes alteran la membrana celular, lo que resulta en lisis celular y liberación intracelular de ATP en la solución. Los inhibidores de la ATPasa inhiben la ATPasa endógena liberada, lo que puede interferir con la medición de ATP. Centrífuga, sedimentación de restos celulares.
Durante la incubación, el ATP liberado con iones de magnesio hace que la luciferina se una a la luciferasa, lo que resulta en la oxidación de la luciferina en oxiluciferina altamente excitada, emitiendo un fotón bioluminiscente al relajarse a su estado fundamental. Usando un lector de microplacas, mida la luminiscencia, indicativa de la concentración de ATP.
Una mayor concentración de ATP representa una mayor viabilidad celular, lo que sugiere que no hay toxicidad significativa del compuesto de prueba en las neuronas.
Para cubrir la placa, agregue 30 microlitros de poli-L-lisina en cada pocillo de una placa de 384 pocillos e incube la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. Lávelo dos veces con PBS y déjelo secar durante aproximadamente 30 minutos.
Agregue 30 microlitros de laminina a cada pocillo, luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante 2 horas. Repita los lavados con PBS y proceda a colocar las celdas. Agregue 20,000 neuroesferas unicelulares en 25 microlitros de medios de diferenciación, a cada pocillo de la placa de 384 pocillos, e incube la placa a 37 grados Celsius durante 5 días.
Se requieren habilidades de pipeteo de alta precisión para sembrar el número exacto de neuroesferas que se desagregan en células individuales. Por lo tanto, se recomienda diferenciar las neuroesferas en neuronas, antes de la siembra para lograr resultados más reproducibles.
Después de la incubación, agregue 5 microlitros de compuesto de prueba a cada pocillo a 6 veces la concentración deseada e incube las células durante otras 24 horas.
Para realizar el ensayo de viabilidad celular, agregue 30 microlitros de reactivo luminiscente a cada pocillo y deje la placa en un agitador durante 2 minutos. Centrifugar la placa de 300 a 400 veces g durante 30 segundos. Luego, incube la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos, protegiéndola de la luz. Después de la incubación, mida la luminiscencia en un lector de microplacas.