Ensayo de complementación de luciferasa dividida para identificar interacciones específicas proteína-proteína

Las interacciones proteína-proteína son cruciales para las funciones celulares vitales.

Para estudiar las interacciones entre las proteínas transmembrana, proteínas de membrana que abarcan la bicapa lipídica de la membrana celular, comience con los pocillos de una placa de pocillos múltiples que contenga un cultivo de células de mamíferos adherentes.

A continuación, agregue una solución que contenga un agente de transfección adecuado y un par de plásmidos de expresión.

Uno de los plásmidos de expresión codifica una proteína transmembrana de interés fusionada con el pequeño fragmento no funcional de la enzima luciferasa; el otro plásmido codifica una segunda proteína transmembrana de interés fusionada con el gran fragmento no funcional de la enzima luciferasa.

Incuba el plato. El agente de transfección facilita la captación celular de los plásmidos de expresión.

Las células transfectadas con éxito expresan las proteínas transmembrana. La interacción entre las proteínas transmembrana expresadas acerca los fragmentos pequeños y grandes que se enfrentan al citoplasma, lo que hace que se unan y formen la enzima luciferasa activa.

Reemplace el medio en los pocillos con medios sin suero para minimizar la luminiscencia de fondo. Agregue una solución de furimazina, un sustrato de luciferasa permeable a las células. La furimazina ingresa a las células, después de lo cual la luciferasa oxida la furimazina, generando luminiscencia de alta intensidad.

Usando un lector de microplacas, mida la luminiscencia, lo que sugiere la fuerte interacción entre las proteínas transmembrana.

Coseche el adherente HEK293T cultivo celular mediante tripsinización y vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento completo dedicado. Coloque las celdas en una placa de 96 pocillos de fondo transparente, lado blanco. Ajuste el número total de pocillos para acomodar todas las combinaciones y controles probados, incluidas las réplicas. Luego, cultive las células durante la noche en condiciones estándar.

Al día siguiente, transfecte las células con las combinaciones deseadas de plásmidos de expresión. Diluya los plásmidos en un medio sin suero a 6,25 nanogramos por microlitro para cada construcción y agregue el reactivo de transfección a base de lípidos en una proporción adecuada de lípidos a ADN.

Incube los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, agregue 8 microlitros de la mezcla de lípido y ADN a los pocillos designados. Mezcle el contenido de la placa con una rotación suave y cultive las células durante 20 a 24 horas en condiciones estándar.

Al día siguiente, reemplace el medio acondicionado en cada pocillo con 100 microlitros de un medio sin suero, asegurándose de que las células no se desprendan al intercambiar el medio.

Justo antes de medir la luminiscencia, mezcle un volumen de furimazina con 19 volúmenes de un tampón de dilución. Agregue 25 microlitros de la solución de trabajo de furimazina en cada pocillo y mezcle suavemente la placa a mano o con un agitador orbital.

Inserte la placa en un lector de microplacas de luminiscencia y equilibre la placa a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Seleccione los pocillos a analizar y lea la luminiscencia con un tiempo de integración de 0,3 segundos. Continúe monitoreando la luminiscencia hasta por dos horas cuando sea necesario.