JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:34 min • July 8th, 2025
La PCR digital de gotas detecta mutaciones indel: inserción o eliminación aleatoria de nucleótidos en el ADN. Esto se logra dividiendo la muestra en pequeñas gotas y amplificando de forma independiente el ADN en cada gota.
Para realizar ddPCR, tome una muestra de ADN que contenga variaciones mutantes y de tipo salvaje del gen diana. Cargue la mezcla de muestras y el aceite en distintos compartimentos de la cámara del generador de gotas que contiene el canal microfluídico.
La muestra y el aceite fluyen rápidamente a través de los canales estrechos, se emulsionan en la unión y se dividen en varias gotas, cada una de las cuales contiene unas pocas moléculas de ADN.
Ahora, tome una placa de PCR con el tampón que contiene cebadores directos e inversos, dNTP, ADN polimerasa termoestable y dos sondas marcadas con diferentes fluoróforos y moléculas extintoras. Cada sonda es específica de un tipo particular de alelo: de tipo salvaje o mutante.
Transfiera las gotas a la placa de PCR. Coloque la placa en un termociclador y ejecute la reacción. Durante la desnaturalización, las hebras de ADN se separan. A la temperatura de recocido, los cebadores y las sondas se recocen en el ADN molde.
La sonda con fluoróforos verdes y naranjas se une a la secuencia de ADN de tipo salvaje y mutante, respectivamente. Más tarde, la ADN polimerasa extiende los cebadores, escindiendo las moléculas de fluoróforo y extinción de la sonda, generando una señal de fluorescencia.
Analizar el producto amplificado. Las gotas que muestran fluorescencia verde contienen la secuencia de ADN de tipo salvaje, mientras que la fluorescencia naranja indica la mutación indel.
Para empezar, prepare 25 microlitros de la mezcla de muestras de PCR o ddPCR de gotas digitales agregando ddPCR super mix, cebadores directos e inversos, sondas HEX o FAM, ADN y agua en las proporciones descritas en el texto. Luego, mezcle bien la reacción por vórtice.
Con una pipeta multicanal de 50 microlitros, cargue 20 microlitros de la mezcla de muestras de ddPCR en la fila central del cartucho. Luego, use una pipeta multicanal de 200 microlitros para cargar 70 microlitros de aceite en la fila inferior sin generar burbujas durante todo el pipeteo.
Coloque la junta, tocando solo los bordes, evitando el área cóncava central, y luego, coloque la placa de forma segura en el generador de gotas y cierre la tapa para comenzar la carrera.
Para transferir la mezcla de inmersión de la fila superior del cartucho a la placa de 96 pocillos, utilice una pipeta multicanal y extraiga 40 microlitros de muestra líquida durante 3 a 5 segundos en un ángulo de 30 a 45 grados. Luego, expulse la mezcla al pocillo lentamente durante más de 3 segundos en un ángulo de 45 grados, dejando que caiga desde un lado, y luego, vaya al segundo tope de la pipeta para expulsar el líquido por completo. Con sellos térmicos de aluminio, selle las placas durante 5 segundos a 180 grados centígrados.
Coloque la placa sellada en el termociclador y establezca las condiciones de PCR para las pautas de entrega de NHEJ estableciendo la desnaturalización inicial a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, configure 40 ciclos de 94 grados Celsius durante 30 segundos para desnaturalizar, 55 grados Celsius durante 1 minuto para recocer y 60 grados Celsius durante 2 minutos para extender.
Después de 40 ciclos, establezca la retención a 98 grados Celsius durante 10 minutos y la retención final a 4 grados Celsius. Utilice una velocidad de rampa de 2 grados centígrados por segundo para todos los pasos. La temperatura de recocido variará según las sondas o cebadores utilizados. Coloque la placa de forma segura en el lector de gotas con el pozo etiquetado A1 en la parte superior izquierda.
Abra el programa y configure la placa designando FAM como el canal de referencia conocido y HEX como el desconocido para cada pocillo. A continuación, cambie el nombre de cada muestra. Ejecute el experimento de lectura de gotas como cuantificación directa mientras guarda la plantilla.