Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 4:34 min. • July 8th, 2025
La PCR digital de gotas detecta mutaciones indel: inserción o eliminación aleatoria de nucleótidos en el ADN. Esto se logra dividiendo la muestra en pequeñas gotas y amplificando de forma independiente el ADN en cada gota.
Para realizar ddPCR, tome una muestra de ADN que contenga variaciones mutantes y de tipo salvaje del gen diana. Cargue la mezcla de muestras y el aceite en distintos compartimentos de la cámara del generador de gotas que contiene el canal microfluídico.
La muestra y el aceite fluyen rápidamente a través de los canales estrechos, se emulsionan en la unión y se dividen en varias gotas, cada una de las cuales contiene unas pocas moléculas de ADN.
Ahora, tome una placa de PCR con el tampón que contiene cebadores directos e inversos, dNTP, ADN polimerasa termoestable y dos sondas marcadas con diferentes fluoróforos y moléculas extintoras. Cada sonda es específica de un tipo particular de alelo: de tipo salvaje o mutante.
Transfiera las gotas a la placa de PCR. Coloque la placa en un termociclador y ejecute la reacción. Durante la desnaturalización, las hebras de ADN se separan. A la temperatura de recocido, los cebadores y las sondas se recocen en el ADN molde.
La son
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