Reacción en cadena de la polimerasa en gradiente para determinar la temperatura óptima de recocido

La reacción en cadena de la polimerasa en gradiente es una técnica para optimizar la temperatura de recocido a la que los cebadores (ADN monocatenario específico de secuencia) se unen a los sitios complementarios en el ADN molde.

Tome una mezcla que contenga cebadores directos e inversos, dNTP y ADN polimerasa termoestable en un tampón apropiado. Agregue el ADN molde y transfiera los componentes a una placa de PCR.

Coloque la placa en un termociclador de gradiente con un bloque calefactor especializado. Esto establece un gradiente lineal de temperatura de recocido entre el rango de 55 °C a 65 °C, con un incremento constante de temperatura en toda la placa.

La reacción calienta la placa a alta temperatura, desnaturalizando el ADN bicatenario en hebras simples y activando la ADN polimerasa. Posteriormente, se baja la temperatura según los valores programados en cada pocillo, facilitando el recocido del cebador.

A una temperatura de recocido por debajo del óptimo, los cebadores se unen de forma no específica al ADN desnaturalizado, lo que lleva a una amplificación no específica durante la reacción de PCR. A una temperatura superior a la óptima, cantidades insuficientes de los cebadores se unen al ADN.

A una temperatura óptima, los cebadores se unen específicamente al ADN objetivo. Luego, la temperatura aumenta ligeramente, lo que permite que la polimerasa extienda los cebadores usando dNTP. Estos ciclos repetitivos de desnaturalización, recocido y extensión conducen a la amplificación del ADN.

Analizar el producto en cada pozo. Los pocillos con temperaturas de recocido no óptimas muestran una amplificación menor o inespecífica.

Una temperatura de recocido óptima produce la máxima amplificación específica del ADN.

Para realizar una PCR de gradiente, comience preparando una mezcla maestra. Luego, retire 19 microlitros de la mezcla maestra para el control sin plantilla, o NTC, en una placa de 96 pocillos. A continuación, añade la plantilla a la mezcla maestra restante. Alícuota 20 microlitros de la mezcla de muestra en la placa de 96 pocillos. Realice PCR siguiendo los parámetros de ciclo y luego genere los perfiles de fusión térmica, utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito.