PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

La reacción en cadena de la polimerasa digital dúplex (ddPCR) permite la detección cuantitativa simultánea de dos marcadores genéticos distintos.

Para comenzar, tome una muestra que contenga dos secuencias objetivo diferentes. Agregue una mezcla que contenga una enzima ADN polimerasa termoestable, dNTP y cebadores específicos para objetivos. A continuación, agregue dos sondas de oligonucleótidos específicas para objetivos diferentes, marcadas con reporteros fluorescentes y una molécula extintora para detectar objetivos amplificados.

La solución se emulsiona con aceite para dividir las secuencias objetivo en numerosas nanogotas. Cada gota que contiene el objetivo actúa como un recipiente de reacción individual.

Inicie el proceso de ciclo térmico para la reacción de amplificación dentro de las nanogotas individuales.

A una alta temperatura de desnaturalización, los objetivos bicatenarios se separan en hebras simples.

Baje la temperatura para alcanzar la temperatura de recocido adecuada, permitiendo que los cebadores y las sondas de oligonucleótidos se unan a la plantilla.

La proximidad del apagador suprime la fluorescencia del reportero. A la temperatura de extensión, la ADN polimerasa extiende los cebadores y escinde la sonda de oligonucleótidos. El reportero no ligado emite fluorescencia.

Pase las gotas a través de un lector de gotas, un sistema de detección de fluorescencia. La detección de fluorescencia simple o doble indica gotas positivas que contienen objetivos, mientras que la ausencia de una señal indica gotas negativas.

La relación entre las gotas positivas y el número total de particiones determina la concentración inicial de las secuencias objetivo.

Para comenzar este procedimiento, primero, prepare concentraciones de stock de 100 micromoles por litro para todos los cebadores en agua de grado molecular y sondas en tampón TE pH 8, como se describe en el texto del protocolo. A continuación, prepare una mezcla maestra mezclando cantidades adecuadas de mezcla de PCR digital, cebadores directos e inversos, la sonda fluorescente y agua libre de nucleasas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces para mezclar, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución.

Dado que la mezcla maestra de dPCR es más viscosa que la mezcla maestra de qPCR convencional, es necesario utilizar la técnica de mezcla por pipeteo para crear una solución homogénea. Esto permite una cuantificación precisa de la dPCR aguas abajo.

Para hacer la mezcla de ensayo para la generación de gotas para procesar muestras por duplicado, pipetee 36 microlitros de la mezcla maestra en una placa de PCR normal. Para cada una de las mezclas maestras de 36 microlitros, mezcle 12 microlitros de plantilla de ADN, dejando los pocillos replicados correspondientes vacíos en la placa. Incluya controles positivos para garantizar que el ensayo funcione correctamente. Incluya controles sin plantilla ni NTC para garantizar que no haya contaminación dentro de la placa y para establecer la línea de base fluorescente más adelante para el análisis de datos.

Antes de configurar el generador de gotas, mezcle las mezclas de ensayo utilizando una pipeta multicanal para pipetear las mezclas hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces. Asegúrese de que la punta de la pipeta permanezca dentro del líquido para evitar que se formen burbujas excesivas dentro de la mezcla.

A continuación, inserte el cartucho uno, que contiene ocho pocillos, en un soporte de cartucho blanco y cierre el soporte del cartucho. El cartucho uno ahora está firmemente en su lugar y no se puede desprender del soporte mientras genera gotas.

Con una pipeta multicanal, transfiera suavemente 20 microlitros de la mezcla de ensayo a la posición media del cartucho marcado como "Muestra" sin introducir burbujas de aire. Pipetee 70 microlitros de aceite de generación de gotas en el lado izquierdo del cartucho marcado como 'Aceite'.

Cubra el cartucho con una junta, asegurándose de que la junta esté plana y sostenida uniformemente por las cuatro garrapatas hacia el borde del cartucho. Presione el botón de luz verde en el generador de gotas para abrir la puerta y colocar el cartucho. Presione el botón nuevamente para cerrar el generador. Una vez que la puerta se cierra, el botón verde se atenúa y la puerta no se puede volver a abrir.

La generación de gotas comenzará inmediatamente y continuará durante aproximadamente 1 minuto.

Mientras la generación de gotas está en curso, coloque el cartucho dos en un segundo portacartuchos blanco y prepárelo de la misma manera que para el cartucho uno. Cuando se complete la generación de gotas, el botón con poca luz se volverá verde.

Abra la puerta del generador de gotas. Retire el soporte blanco del cartucho que contiene el cartucho uno y déjelo a un lado. Coloque el cartucho dos en el generador de gotas.

Retire la junta del cartucho uno y deséchelo. No desenganche el soporte del cartucho blanco, ya que la acción puede romper las gotas recién generadas.

Con una pipeta multicanal ajustada a 40 microlitros, inserte las puntas en la tercera columna del cartucho marcada con gotas en un ángulo de 45 grados y pipetee lentamente todas las gotas. Transfiéralos a la placa de PCR final colocando la punta de la pipeta contra la pared del pocillo aproximadamente a la mitad y expulsando la gota lentamente.

De la misma manera, cuando se complete la generación de gotas para el cartucho dos, retire la junta del cartucho dos y transfiera las gotas generadas a la placa de PCR final. Coloque una cubierta de papel de aluminio perforable encima de la placa y colóquela en un sellador de placas. Pon el sellador a 180 grados centígrados. Presione "Play" en el sellador y selle durante 10 segundos.

Para comenzar este procedimiento, coloque la placa de PCR final sellada en el termociclador. Utilice un termociclador que sea compatible con la placa de PCR final y con una velocidad de rampa de temperatura de 2 grados centígrados por segundo.

Ejecute el siguiente programa térmico: 10 minutos a 95 grados Celsius seguidos de 40 ciclos de 30 segundos a 94 grados Celsius y 60 segundos a 60 grados Celsius seguidos de una retención de 10 minutos a 98 grados Celsius. Al finalizar el ciclo, transfiera la placa a un lector de gotas para la medición automática de la fluorescencia en cada gota en cada pocillo.

Asegúrese de que las gotas estén a temperatura ambiente antes de continuar con la lectura de las gotas. Comience abriendo el software adjunto para configurar la lectura de gotas. En el menú predeterminado "Configuración" que contiene un esquema de una placa vacía de 96 pocillos, haga doble clic en el pocillo A1 para abrir el menú que contiene tres secciones: "Muestra", "Ensayo 1" y "Ensayo 2".

En la sección de muestra, escriba el ID de muestra en el cuadro con la etiqueta "Nombre" y marque la casilla a la derecha marcada como "Aplicar". A continuación, haga clic en el menú desplegable etiquetado como "Experimento". Elija "ROJO" para la detección de eventos raros y haga clic en 'Enter'.

Vaya a la sección indicada como "A1". En la sección "Nombre", complete el ensayo y haga clic en 'Enter'. En el cuadro de abajo etiquetado como "Tipo", haga clic en el menú desplegable, elija "Canal 1 desconocido" y haga clic en 'Enter'.

Vaya a la sección indicada como "A2". En la sección "Nombre", complete el ensayo y haga clic en 'Enter'. En el cuadro de abajo etiquetado como "Tipo", haga clic en el menú desplegable, elija "Canal 2 desconocido" y haga clic en 'Enter'.

Toda la información de los pasos anteriores ahora está presente en el pozo A1.

Asigne un nombre a todos los pocillos posteriores que contengan gotas. Para ahorrar tiempo total de configuración, haga clic en 'Shift' o 'Control' para elegir varios pocillos simultáneamente. Cuando la representación digital de la placa refleje la placa física, presione "OK" en la parte inferior derecha del menú. En el nuevo menú que aparece en la parte superior del esquema de la placa, en la sección "Plantilla", elija "Guardar como" y asigne un nombre y guarde la placa.

A la izquierda de la pantalla, haga clic en "Ejecutar" y seleccione el conjunto de tintes apropiado en la ventana emergente "Opciones de ejecución". La recopilación de datos se iniciará y se mostrará en tiempo real en el software.