PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real para el diagnóstico de infecciones virales

La PCR cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real es útil para identificar infecciones virales.

Comience con una muestra que contenga el ARN viral objetivo. Agregue cebadores específicos para objetivos, que ayudan tanto en la síntesis como en la amplificación del ADN, junto con la enzima transcriptasa inversa y los dNTP.

Agregue ADN polimerasa termoestable, una enzima para amplificar el ADN a través de los ciclos de PCR, y SYBR green, un tinte que se intercala en ADN de doble cadena, dsDNA. Coloque la reacción en un termociclador. Establezca una temperatura adecuada para que los cebadores se unan al ARN objetivo.

La transcriptasa inversa agrega dNTP al cebador mientras escinde simultáneamente el ARN molde, sintetizando ADNc.

Aumentar la temperatura, inactivando la transcriptasa inversa. Baje la temperatura, permitiendo que los cebadores se recocan en el ADNc para su posterior amplificación. Aumente la temperatura para alcanzar el paso de extensión, donde la ADN polimerasa extiende los cebadores, sintetizando dsDNA.

Los ciclos consecutivos dan como resultado una amplificación exponencial de dsDNA. El verde SYBR se une al ADN en cantidades cada vez mayores, lo que provoca un aumento proporcional en la emisión de fluorescencia. Grafique la señal de fluorescencia detectada a lo largo de los ciclos.

Una curva de amplificación positiva indica la presencia de ARN viral en la muestra.

Aumente la temperatura gradualmente para alcanzar la temperatura de fusión, desnaturalizando el dsDNA en hebras simples. Las moléculas de colorante unidas se liberan, perdiendo su fluorescencia. Grafique la fluorescencia decreciente contra la temperatura.

Un pico correspondiente a la temperatura de fusión específica del virus confirma la infección viral.

Planifique el diseño de su placa de PCR con una hoja de cálculo, teniendo en cuenta tanto las muestras de prueba como las de control. Prepare una estación de trabajo de PCR desinfectando las superficies y, si usa un gabinete UV, encienda la luz UV 10 minutos antes de comenzar.

Retire los reactivos y los cebadores del congelador para descongelar, pero mantenga la mezcla de enzimas en hielo en todo momento. Mezcle los reactivos y centrifugue brevemente para recolectar el líquido. Preparar mezclas maestras de PCR para lisavirus y beta-actina, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Deje las mezclas maestras en hielo hasta que estén listas para usar. Mezcle y centrifugue las mezclas maestras preparadas y dispense 19 microlitros en los pocillos correspondientes de la placa o tira de tubo compatible con la máquina de PCR.

En una habitación separada o en un gabinete UV, agregue con cuidado 1 microlitro del ARN preparado. Si usa un gabinete UV, encienda la luz UV 10 minutos antes de comenzar. Después de las muestras de prueba, agregue el control positivo y el control sin plantilla.

Al agregar el ARN a las mezclas maestras, asegúrese de que se agregue al pocillo correcto. Use el plan de platos para ayudar en este paso.

Selle la placa, verifique que las tapas estén planas a través de la placa y gírela hacia abajo para recoger todo el líquido en el fondo de los pocillos. Asegúrese de que cada pocillo tenga el mismo volumen de líquido y que no se vean burbujas. Luego, transfiera las muestras a la máquina de PCR.

Abra el programa, eligiendo 'SYBR Green' con 'Disociación'. Seleccione los pocillos a analizar, eligiendo "Desconocido" como tipo de muestra y "SYBR" como colorante fluorescente. Etiquete los pocillos en el diseño de la placa con la información de la muestra, incluso si el ensayo es para el pocillo de Lyssavirus o para la beta-actina.

Haga clic en "Configuración del perfil térmico" y modifique las condiciones del ciclo térmico como se especifica en el manuscrito. Haga clic en "Inicio", luego, elija una ubicación para guardar el archivo y marque la casilla para apagar la lámpara al final de la ejecución. Cuando aparezca la opción de comenzar antes del calentamiento de la lámpara, haga clic en "Ejecutar ahora", pero asegúrese de que la lámpara tenga menos de 15 minutos para calentarse.