Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:02 min. • July 8th, 2025
La microesfera-PCR utiliza una esfera de tamaño micro acoplada a oligonucleótidos en su superficie, lo que permite la amplificación preferencial del ADN monocatenario.
Para comenzar la PCR de microesferas, tome una mezcla de reacción que contenga hebras de ADN monocatenario moldeadas, cebadores directos con una etiqueta de nucleótido adicional, ADN polimerasa termoestable, dNTP y microesferas que muestren sondas de oligonucleótidos monocatenarios.
Coloque el tubo en un termociclador y haga funcionar en las condiciones definidas.
En el primer ciclo, a la temperatura de recocido, el ADN molde se une a la sonda en la superficie de la microesfera, de modo que el ADN molde funciona como la hebra sensorial. Durante la extensión, la polimerasa extiende el ADN y el dúplex permanece unido a la microesfera.
En el siguiente ciclo, durante la desnaturalización, el ADN molde se separa de la microesfera, dejando la hebra de la sonda unida a la superficie, sirviendo como molde para una nueva hebra.
Durante el recocido, el cebador etiquetado se une a la hebra antisentido. Más tarde, la polimerasa lo extiende para sintetizar la hebra de sentido con la etiqueta de nucleótido.
Repita el ciclo varias veces para generar múltiples copias de ADN monocatenario sensible, que entran en la solución, mientras que los contaminantes bicatenarios permanecen adheridos.
Transfiera los productos de PCR a un tubo que contenga un tampón de carga. Cargue el producto y los marcadores en diferentes pocillos del gel y separe mediante electroforesis en gel de agarosa.
Los ADN molde forman una banda tenue de bajo peso molecular, mientras que una banda intensa de alto peso molecular confirma la amplificación del ADN monocatenario.
Obtenga aproximadamente 25 microesferas mediante recuento microscópico utilizando un microscopio óptico con un aumento de 40X. Después de esto, combine todos los reactivos como se describe en el protocolo de texto. Coloque las muestras en un termociclador e inicie la PCR asimétrica en las condiciones adecuadas.
La recolección de sobrenadante después de una PCR simétrica es uno de los pasos más críticos porque es un proceso importante para generar ADN de una sola hebra con microesferas.
Después de la amplificación, agregue ocho microlitros de tampón de carga 6X a cada muestra. Cargue 15 microlitros de cada muestra en gel de agarosa al 2%. Luego, realice la electroforesis a 100 voltios durante 35 minutos en 1X tampón TAE.