Reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para detectar la metilación del ADN en leucocitos

La metilación de residuos de citosina del ADN es un rasgo característico de los leucocitos o glóbulos blancos.

La reacción en cadena de la polimerasa en gotas múltiples, o mdPCR, permite la identificación simultánea de múltiples regiones de ADN metiladas dentro de los leucocitos.

Prepare una mezcla que contenga tampón de reacción, ADN polimerasa y agua libre de nucleasas. Agregue cebadores directos e inversos y sondas de hidrólisis fluorescente específicas para cada región objetivo. Las sondas comprenden reporteros de fluoróforos de diferentes colores unidos a extintores para inhibir la emisión de fluorescencia.

Agregue ADN convertido en bisulfito, en el que las citosinas no metiladas se desaminan en uracilos mientras que las citosinas metiladas permanecen sin cambios. Mezclar.

Llene una jeringa de vidrio con una mezcla de aceite portador y tensioactivo y otra con una mezcla de aceite portador y PCR, y conéctelas al generador de gotas microfluídicas. La mezcla de PCR acuosa de aceite portador se emulsiona en gotas de tamaño subnanolitro. El tensioactivo estabiliza la emulsión y evita la fusión de gotas.

Recoja las gotas y realice la PCR. Dentro de cada gota, la alta temperatura de desnaturalización desnaturaliza el ADN bicatenario en ADN monocatenario y activa la polimerasa. La temperatura de reacción se reduce, lo que permite el recocido específico del sitio de los cebadores y las sondas.

A medida que la polimerasa se une y extiende el dúplex de cebadores de ADN, los uracilos se amplifican como timinas, mientras que las citosinas metiladas se amplifican como citosinas, lo que permite distinguir regiones metiladas y no metiladas. La polimerasa escinde y libera aún más al reportero de la sonda, causando emisión de fluorescencia.

Después de la PCR, visualice las gotas bajo un microscopio. El color de fluorescencia indica la presencia de dianas específicas de ADN metilado.

Para la generación de gotas, mezcle 1 microlitro de ADN convertido en bisulfito con una mezcla maestra de sonda recién preparada en un tubo de PCR y recoja la muestra con una breve centrifugación. Utilice accesorios de PEEK para conectar tubos fluídicos desechables a dos jeringas de vidrio de precisión de 250 microlitros de volumen, y llene previamente una jeringa de vidrio de precisión con 250 microlitros de aceite portador que contenga un 5% de tensioactivo fluorado y una jeringa de vidrio de precisión con 50 microlitros de aceite portador.

Cuando se hayan cargado ambas jeringas, cargue 100 microlitros de la mezcla de PCR en la jeringa de aceite portador y coloque un dispositivo microfluídico de gotas en la platina de un microscopio óptico vertical equipado con una cámara de alta velocidad.

Para la observación y el registro de la formación de gotas en tiempo real, coloque las jeringas precargadas en una bomba de jeringa programable y use la unión PEEK con accesorios para conectar el tubo de las jeringas al tubo de los respectivos canales de entrada del dispositivo microfluídico de gotas.

Coloque el tubo desde la salida del generador de gotas hasta el interior de un tubo de PCR de 0,5 mililitros y ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 2 microlitros por minuto. Deje que el tamaño de la gota se estabilice antes de recolectar la emulsión resultante. Recoja lenta y cuidadosamente la emulsión de la parte superior del tubo y transfiera 75 microlitros de la solución a un tubo de PCR de 200 microlitros para ciclos térmicos.

Luego, confirme que el contenido de aceite en el tubo de PCR coincida estrechamente con el volumen de la fase dispersa para evitar la coalescencia de las gotas durante el ciclo térmico y coloque el tubo de 200 microlitros en el termociclador.