Dot Blot cuantitativo para estimar las proteínas diana en un lisado de tejidos

El transferencia de puntos cuantitativo, o QDB, es una técnica útil para cuantificar la concentración de proteínas diana en una muestra. Una vez que la muestra se inmoviliza en una membrana polimérica, las proteínas se pueden detectar mediante inmunotransferencia.

Para comenzar, tome una placa QDB, una placa de múltiples pocillos con una membrana de nitrocelulosa unida al fondo de cada pocillo. Agregue la muestra, un lisado de tejido que contiene la proteína objetivo, en el centro de la membrana dentro del pocillo.

Deje que la muestra se seque. La proteína diana se une a la membrana a través de interacciones no covalentes.

Agregue una solución de bloqueo. Las proteínas de la solución se adhieren a los sitios no unidos en la membrana, evitando la unión no específica de los reactivos de detección.

A continuación, agregue una solución que contenga anticuerpos primarios que se unan a la proteína diana en la muestra. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.

Luego, agregue una solución de anticuerpos secundarios. Estas moléculas, marcadas con una enzima peroxidasa, se unen a los anticuerpos primarios unidos a proteínas. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.

Finalmente, agregue una solución que contenga un sustrato quimioluminiscente y peróxido de hidrógeno. Utilizando peróxido de hidrógeno, la peroxidasa unida a anticuerpos oxida el sustrato y emite luz. Con un lector de placas, mida la intensidad de luminiscencia de la muestra.

Genere una curva de luminiscencia estándar utilizando una dilución en serie con concentraciones conocidas de la proteína diana. Grafique el valor de luminiscencia medido de la muestra en la curva para determinar la concentración de proteína objetivo.

En este procedimiento, coloque una caja de puntas de pipeta vacía debajo de la placa QDB para evitar que la parte inferior de la placa toque la superficie de la mesa. Cargue hasta 2 microlitros de la muestra en el centro de la membrana en la parte inferior de una unidad individual de la placa QDB.

Nunca permita que la parte inferior de la placa QDB toque ninguna superficie, mientras se carga, y no cargue demasiado para el pozo individual. No experimenta más de 4 microlitros por pozo.

A continuación, deje la placa QDB cargada durante una hora a temperatura ambiente, o deje la placa cargada a 37 grados centígrados durante quince minutos en un espacio bien ventilado. Para bloquear la placa, sumerja la placa QDB en el tampón de transferencia y agítela suavemente durante 10 segundos.

Después de eso, enjuague la placa QDB suavemente con TBST tres veces y luego lave la placa durante cinco minutos en TBST bajo agitación constante. Posteriormente, bloquee la placa QDB con tampón de bloqueo durante una hora bajo agitación constante. Ahora, diluya el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo a una concentración elegida y agregue 100 microlitros a cada pocillo individual de una placa ordinaria de 96 pocillos.

Inserte la placa QDB en la placa de 96 pocillos e incube las placas combinadas durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados centígrados bajo agitación constante. Después de eso, enjuague la placa suavemente con TBST tres veces, antes de lavarla con TBST tres veces, cada vez durante cinco minutos bajo agitación constante.

A continuación, diluya el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración elegida y alícuota 100 microlitros en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego, incube la placa QDB dentro de la placa cargada de 96 pocillos durante una hora a temperatura ambiente bajo agitación constante. Enjuague la placa QDB suavemente tres veces con TBST y luego lave la placa tres veces, cinco minutos cada una con TBST bajo agitación constante.

Para la cuantificación, prepare el sustrato ECL y la alícuota en una placa de 96 pocillos a 100 microlitros por pocillo. Luego, inserte la placa QDB dentro de la placa de 96 pocillos durante dos minutos bajo agitación constante. Después de eso, retire la placa QDB de la placa de 96 pocillos y agite brevemente para eliminar el exceso de líquido. Posteriormente, coloque la placa sobre una placa de microtitulación blanca. A continuación, encienda el lector de microplacas y seleccione la placa con cubierta en la interfaz de usuario, antes de colocar las placas combinadas dentro del lector de microplacas para la cuantificación.