Western Blotting cuantitativo para estimar los niveles de expresión de proteínas

El western blot cuantitativo, una técnica basada en la normalización de proteínas totales, es útil para cuantificar los niveles de expresión de proteínas diana.

Para comenzar, cargue lisado de tejido en los pocillos de un gel de gradiente de poliacrilamida. El lisado contiene la proteína diana, junto con otras proteínas celulares.

Ejecute el gel a un voltaje apropiado para la separación electroforética de las proteínas de la muestra a lo largo del gradiente. Al finalizar, coloque el gel encima de la membrana polimérica de una pila de transferencia.

Aplique una corriente eléctrica para transferir las proteínas separadas a la membrana. A continuación, coloque la membrana en una tinción de proteína total fluorescente. Las moléculas de colorante cargadas en la tinción se unen electrostáticamente a todas las proteínas de la membrana.

Agregue una solución de bloqueo. Las proteínas de la solución se unen a la membrana, por lo tanto. evitando la unión no específica de los reactivos de detección. Agregue un anticuerpo primario que se una solo a la proteína diana. Luego, agregue un anticuerpo secundario, marcado con un fluoróforo, que se adhiere al anticuerpo primario.

Excite la muestra con