Western Blotting cuantitativo para estimar los niveles de expresión de proteínas

El western blot cuantitativo, una técnica basada en la normalización de proteínas totales, es útil para cuantificar los niveles de expresión de proteínas diana.

Para comenzar, cargue lisado de tejido en los pocillos de un gel de gradiente de poliacrilamida. El lisado contiene la proteína diana, junto con otras proteínas celulares.

Ejecute el gel a un voltaje apropiado para la separación electroforética de las proteínas de la muestra a lo largo del gradiente. Al finalizar, coloque el gel encima de la membrana polimérica de una pila de transferencia.

Aplique una corriente eléctrica para transferir las proteínas separadas a la membrana. A continuación, coloque la membrana en una tinción de proteína total fluorescente. Las moléculas de colorante cargadas en la tinción se unen electrostáticamente a todas las proteínas de la membrana.

Agregue una solución de bloqueo. Las proteínas de la solución se unen a la membrana, por lo tanto. evitando la unión no específica de los reactivos de detección. Agregue un anticuerpo primario que se una solo a la proteína diana. Luego, agregue un anticuerpo secundario, marcado con un fluoróforo, que se adhiere al anticuerpo primario.

Excite la muestra con un láser. Registre la fluorescencia emitida por las moléculas de colorante de la tinción de proteína total y los fluoróforos unidos a anticuerpos en sus longitudes de onda correspondientes.

Para calcular el valor de carga de proteína normalizado, divida la señal de proteína total de cada carril por el valor más alto. Divida la señal de la proteína diana por el valor de carga normalizado correspondiente para determinar la expresión relativa de la proteína diana.

Para la electroforesis, configure un gel de gradiente Bis-Tris prefabricado de 4 a 12% en el sistema de cámara de electroforesis de gel y cargue 3,5 microlitros de un estándar de proteína en el pozo. Cuando utilice un estándar interno para la normalización entre membranas, cargue una cantidad igual a las otras muestras en los primeros tres pocillos junto a la escalera de proteínas y cargue 30 microgramos de cada muestra en los pocillos restantes. Luego, pase las muestras a través del gel de apilamiento a 80 voltios durante 10 minutos seguidos de 150 voltios durante 45 a 60 minutos adicionales.

Al final de la electroforesis, para ensamblar la pila de transferencia, coloque el gel de proteína en la pila inferior que contiene la membrana de difluoruro de polivinilideno seguido del papel de filtro. Use el rodillo secante para eliminar las burbujas de aire y coloque la pila superior en la parte superior del papel de filtro, antes de enrollar la pila nuevamente para eliminar las burbujas de aire.

Transfiera toda la pila al dispositivo de transferencia con el electrodo en el lado izquierdo del dispositivo y coloque la esponja de gel encima de la pila, de modo que la esponja esté alineada con los contactos eléctricos correspondientes en el dispositivo.

Después de cerrar la tapa, seleccione e inicie el programa apropiado. Al final del programa, corte la membrana al tamaño del gel y lave la membrana cortada rápidamente con agua doble destilada antes de continuar con la tinción de proteína total.

Para la tinción total de proteínas, enrolle la membrana en un tubo de 50 mililitros con el lado de la proteína hacia adentro y etiquete la membrana con 5 mililitros de solución de tinción de proteínas en un rodillo durante 5 minutos a temperatura ambiente en una campana extractora.

Al final de la incubación, lave la membrana rápidamente con 5 mililitros de solución de lavado, devolviendo el tubo brevemente al rodillo entre lavados, seguido de un breve enjuague con agua ultrapura. Agregue 3 milímetros de tampón de bloqueo a la membrana y regrese la membrana al rodillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Reemplace el tampón de bloqueo con el anticuerpo primario de interés a la concentración optimizada adecuada e incube la membrana en el rodillo durante la noche a 4 grados centígrados.

Al día siguiente, lave la membrana 6 veces durante 5 minutos con 5 mililitros de PBS fresco por lavado en el rodillo a temperatura ambiente. Después del último lavado, incube la membrana con la solución de anticuerpos secundarios adecuada en el rodillo durante 1 hora a temperatura ambiente seguida de 3 lavados durante 30 minutos por lavado. Después del último lavado, seque la membrana y use papel de aluminio para mantener la membrana protegida de la luz.

Para la adquisición de imágenes, coloque la membrana en el escáner con el lado de la proteína hacia abajo y seleccione el área de escaneo en el software. A continuación, adquiera imágenes en ambos canales y exporte las imágenes a un programa de análisis de imágenes adecuado.

Muestre el canal de 700 nanómetros para mostrar el resultado total de la tinción de proteínas, seleccione "Análisis" y dibuje un rectángulo para definir el área de interés para la normalización. A continuación, copie y pegue la primera área del rectángulo en cada muestra individual para asegurarse de que la región definida tenga el mismo tamaño para todas las líneas analizadas.

Para cuantificar la concentración de proteína en cada carril, copie los resultados tanto de la tinción de proteína total como de la proteína de interés en un programa de hoja de cálculo y determine la señal de tinción de proteína total más alta. Luego divida cada valor de señal de tinción de proteína total por este valor para obtener el valor de carga de proteína normalizado y divida el valor de señal de 800 nanómetros de cada muestra individual por su valor de proteína normalizado correspondiente para calcular la relación relativa de expresión de proteína en diferentes muestras.