Western Blotting unicelular para determinar la heterogeneidad celular

Los sitios de inflamación contienen varias células inmunitarias, incluidos monocitos, macrófagos y leucocitos.

Para identificar una población celular heterogénea mediante western blot unicelular, tome un chip de transferencia prehidratado, que consiste en un gel de poliacrilamida fotoactivable estampado en bloques. Cada bloque tiene numerosos micropozos. El patrón en varios bloques captura varias celdas en paralelo.

Agregue una suspensión que contenga una población de células heterogéneas. Las dimensiones del pozo permiten que las células individuales se asienten. Sumerja el chip en una cámara de electroforesis llena de un tampón adecuado. Las moléculas de detergente en el tampón alteran la membrana de la célula, liberando contenido celular.

Aplicar un campo eléctrico. Las proteínas liberadas migran a través del gel, separándose en bandas de distintos tamaños. Lave el chip con un tampón de lavado para eliminar las moléculas unidas de forma no específica, dejando solo las proteínas celulares, incluidas las proteínas marcadoras deseadas.

Exponer el gel a la luz ultravioleta, activando su superficie e inmovilizando las proteínas.

Agregue un cóctel de anticuerpos primarios que se unen específicamente a proteínas marcadoras distintivas de cada tipo de célula, formando complejos proteína-anticuerpo primario. Dispense una mezcla de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, que se unen a sus respectivos anticuerpos primarios, marcando la proteína marcadora específica de la célula correspondiente.

Coloque el chip en un escáner. Mida la intensidad de fluorescencia que es proporcional al nivel de expresión del marcador proteico correspondiente específico para una sola célula de la suspensión celular de la muestra.

Para un análisis de Western blot unicelular, agregue 1 mililitro de suspensión unicelular diluida a un chip Western blot unicelular rehidratado en el fondo de una placa de Petri de 10 centímetros. Después de cinco a quince minutos, examine el chip bajo microscopía de campo claro. Aproximadamente del 15% al 20% de los micropocillos deben estar ocupados por una sola celda, y menos del 2% de los pocillos deben contener dos o más células.

Si el chip se ha cargado correctamente, incline el plato 45 grados y lave el chip tres veces con un tampón de suspensión para eliminar las células no capturadas. Después del último lavado, cargue con cuidado el chip en la celda de electroforesis de un instrumento Western de una sola celda con el lado del gel hacia arriba y cubra todo el chip Western blot de una sola celda con tampón de lisis / funcionamiento. Inicie la lisis celular y haga funcionar el instrumento de acuerdo con los parámetros de experimentación apropiados.

Al final de la carrera, enjuague el chip con dos lavados de 10 minutos con tampón de lavado nuevo por lavado a temperatura ambiente. Después del segundo lavado, agregue 80 microlitros de la solución de anticuerpos primaria de interés a la cámara de sondeo de anticuerpos y baje el chip con el lado del gel hacia abajo para que la solución de anticuerpos se absorba a través del chip.

Después de dos horas a temperatura ambiente, lave el chip tres veces en un tampón de lavado y una vez en agua en una coctelera. Incubar el chip con un anticuerpo secundario apropiado durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz. Al final de la incubación, lave el chip tres veces con tampón de lavado y gire el chip en una centrifugadora de portaobjetos para eliminar cualquier tampón de lavado restante.

Para quitar el chip Western blot de una sola celda, coloque una rejilla de tubo de 50 mililitros en un baño de agua a 60 grados Celsius con el agua a solo 1 centímetro por encima de la rejilla. En una campana extractora, agregue 40 mililitros de tampón de extracción y 320 microlitros de beta-mercaptoetanol a un recipiente. Coloque el chip en una placa de Petri de 10 centímetros dentro del recipiente y selle el recipiente con parafilm.

Luego, coloque el recipiente dentro de la rejilla del tubo en el baño de agua. Después de 90 minutos, transfiera con cuidado el chip a una nueva placa de Petri y lave brevemente el chip una vez con tampón de lavado antes de agregar 15 mililitros de tampón de lavado nuevo a la placa de Petri para un lavado de 15 minutos en la coctelera.