Southern Blotting para detectar recombinaciones homólogas en el genoma de células madre embrionarias de ratón

La transferencia Southern implica la identificación de secuencias de ADN específicas de una mezcla compleja de ADN a través de la detección basada en sondas.

Para identificar eventos de recombinación homóloga o HR en células madre embrionarias de ratón con Southern blotting, obtenga ADN genómico de las células. Incubar con una enzima de restricción para digerir el ADN en fragmentos más pequeños.

Cargue el ADN en un gel de agarosa. Realice electroforesis para la separación de fragmentos basada en el tamaño.

Trate el gel con una solución ácida para eliminar las bases de purina, aflojando el ADN bicatenario, dsDNA. Agregue una solución desnaturalizante alcalina. El pH alto interrumpe los enlaces de hidrógeno, desnaturalizando el dsDNA suelto en ADN monocatenario, ssDNA. Incubar con una solución neutralizante para neutralizar el pH del gel.

Ensamble el sistema de transferencia usando papeles secantes, una membrana de nailon y gel apilado encima de la membrana. Realice la transferencia. El ssDNA se transfiere del gel a la membrana a través de la acción capilar descendente.

Irradiar la membrana con rayos ultravioleta, reticulando e inmovilizando el ADN. Coloque la membrana en un tubo que