Northern Blot para detectar y cuantificar microARN específicos en el extracto de ARN total de tejido vegetal

Los microARN, miARN, son ARN pequeños, monocatenarios y no codificantes. Los miARN se incorporan a un complejo multiproteico y se unen aún más a secuencias de ARNm diana complementarias para regular negativamente la expresión génica.

Para detectar miARN específico del ARN total de los tejidos vegetales, agregue un colorante de carga de gel que contenga colorantes de seguimiento y formamida, un agente desnaturalizante del ARN. Caliente la muestra para desnaturalizar el ARN y evitar la formación de estructuras secundarias antes de la electroforesis.

Cargue la muestra y los marcadores de ARN estándar en pocillos de un gel de poliacrilamida desnaturalizante preensamblado. Ejecute electroforesis, facilitando la separación basada en el tamaño de los fragmentos de ARN.

Transfiera el gel a papeles de filtro prehumedecidos en un casete electrosecante. Alinee una membrana secante de nailon empapada en tampón sobre el gel. Luego, apile los papeles de filtro prehumedecidos. Realizar electrotransferencia.

La corriente eléctrica hace que el ARN cargado negativamente, incluido el miARN, salga del gel hacia la superficie de la membrana de nailon cargada positivamente. Exponga la membrana a la luz ultravioleta; esto reticula los ARN a la membrana, evitando así la pérdida de ARN.

Incubar la membrana en tampón de hibridación que contenga agentes bloqueadores que ocupen los sitios de unión no específicos para reducir el ruido de fondo.

Agregue una sonda de oligonucleótidos de ARN radiomarcada complementaria al miARN objetivo para unirse específicamente a él. Lave la membrana con tampón, eliminando las sondas sueltas.

Utilice un sistema de imágenes de fósforo para detectar y cuantificar las intensidades de la señal de hibridación radiactiva. La señal de alta resolución indica una expresión específica de miARN en el tejido vegetal.

Detenga la ejecución previa del gel.

Lave bien los pocillos antes de cargar la muestra para eliminar los depósitos de urea dentro de los pocillos. Caliente las muestras de ARN resuspendido a 98 grados durante 1 minuto. Cargue las muestras calientes en los pocillos con puntas capilares. Evite introducir burbujas de aire.

Carga completa de todas las muestras y montaje de la tapa. Ejecute el gel a 80 voltios durante 3 horas o hasta que el azul de bromofenol se agote por completo. Utilice una membrana de nailon cargada positivamente para la transferencia. Córtalo a las dimensiones de la placa de vidrio. Etiqueta la membrana en su esquina superior derecha. Coloque suavemente la membrana sobre la superficie del agua estéril Milli-Q. Asegúrese de colocar la etiqueta hacia abajo frente a la superficie del agua.

Tome una bandeja limpia y prepare un sándwich de gel para electrotransferencia. Coloque el lado gris del casete hacia abajo. Vierta 1X TBE ligeramente por encima del nivel del casete. Humedezca previamente la almohadilla de fibra en 1X TBE y apriétela para eliminar las burbujas de aire. Corta dos trozos de papel secante del tamaño de una almohadilla de fibra.

Humedezca previamente un trozo de papel secante en 1X TBE y colóquelo sobre la almohadilla de fibra. Elimine las burbujas de aire haciendo rodar una pipeta de plástico sobre el papel. Humedezca previamente otro trozo de papel secante en un TBE 1X y colóquelo sobre el casete. Dar la vuelta para eliminar las burbujas de aire. Ahora la configuración del sándwich está lista para la electrotransferencia.

Después de completar la electroforesis, detenga la carrera y retire la tapa del aparato. Retire el casete en funcionamiento de la configuración. Saque las placas de vidrio del casete en funcionamiento.

Retire con cuidado el gel del conjunto. Colóquelo sobre el papel secante de modo que la primera muestra de ARN cargada esté hacia su derecha. Sumerja suavemente la membrana previamente empapada en 1X TBE y colóquela sobre el gel con la etiqueta hacia abajo. No permita que la membrana y el gel se sequen. Dé la vuelta suavemente para eliminar las burbujas de aire.

Sumerja un trozo de papel secante en 1X TBE y colóquelo sobre la membrana. Elimina las burbujas de aire. Coloque otro trozo de papel secante y retire las burbujas de aire. Complete el sándwich colocando la almohadilla de fibra sobre el ensamblaje. Cierre el casete firmemente.

Coloque el casete transblot en el módulo. Llene el tanque con 1X TBE, pH 8.2, hasta la marca de secado. Cierre la tapa del aparato y transfiera a 10 voltios durante la noche a 4 grados o en una cámara frigorífica. Mantenga el reticulante UV listo y configúrelo a 1,200 justo antes de completar la electrotransferencia.

Una vez completada la transferencia, retire el casete del módulo. Colocar la membrana húmeda sobre una hoja A4 colocando el lado marcado hacia arriba. Reticular el ARN a la membrana mediante irradiación con luz UV de 254 nanómetros a 120 milijulios. La transferencia reticulada puede almacenarse a 4 grados o usarse para hibridación.

Diseñe una sonda que sea completamente complementaria al ARN pequeño que debe detectarse y etiquete la sonda en su extremo principal 5 utilizando la enzima PNK y combine los componentes como se muestra. Incube la mezcla de reacción a 37 grados durante 30 minutos.

Después de 30 minutos de incubación, use columnas G-25 para separar las sondas no marcadas de la mezcla de reacción. Para mejorar el etiquetado de la sonda, prepare la columna G-25 antes de usarla. Coloque la transferencia, con el lado del ARN hacia arriba, dentro de una botella de hibridación. Mezcle vigorosamente el tampón de hibridación antes de usarlo. Agregue 10 ml de tampón de hibridación y coloque la botella de hibridación dentro de un horno de hibridación mantenido a 35 grados con rotación.

Realice la prehibridación durante 20 a 30 minutos. Después de la prehibridación, retire la botella del horno. Agregue la sonda etiquetada en el tampón de hibridación suavemente. Asegúrese de que no se creen burbujas de aire. Incube la mancha dentro del horno a 35 grados con rotación durante 12 horas.

Después de la hibridación, retire el tampón de hibridación del frasco. Realice un lavado rápido de las manchas con el tampón de lavado I. Este paso se realiza para eliminar el exceso de solución de hibridación de las manchas. Además, incube las manchas a 35 grados durante 30 minutos usando el tampón de lavado I. Realice otro lavado usando el tampón II a 35 grados durante 30 minutos.

Después de lavar la mancha, colóquela dentro de una cubierta de hibridación, retire el exceso de tampón y séllela. Colóquelo dentro de un casete y expóngalo a una pantalla de generador de imágenes de fósforo libre de radiación durante 12 horas. Detecte la señal de hibridación con Typhoon Biomolecular Imager y analice los resultados con el software ImageJ.