Biodetección de efecto de campo basada en biosensores de grafeno para detectar interacciones proteína-proteína

Las interacciones proteína-proteína, IBP, son fundamentales para regular la mayoría de los procesos biológicos.

Para detectar IBP mediante biodetección de efecto de campo, comience con un chip de transistor de efecto de campo de grafeno. El chip comprende una superficie de grafeno funcionalizada con carboxilo como canal semiconductor entre la fuente y los electrodos de drenaje.

Incube el chip con una solución fresca de carbodiimida y N-hidroxisulfosuccinimida, sulfo-NHS, en un tampón zwitteriónico. Este tampón crea un pH adecuado, lo que permite que la carbodiimida y el sulfo-NHS activen los grupos carboxilo funcionalizados del chip, formando ésteres reactivos a las aminas.

Agregue la solución de proteína objetivo. Las aminas primarias reaccionan con los ésteres reactivos a las aminas, inmovilizando las proteínas del chip a través de la formación de enlaces amida. Agregue una solución de enfriamiento que contenga aminas para bloquear los ésteres reactivos a las aminas no unidos, evitando la unión no específica.

Inserte el chip en el lector electrónico y calibrícelo con un tampón. El lector aplica un voltaje constante entre los electrodos. Se mide el flujo de corriente eléctrica resultante entre los electrodos en la condición de analito no unido.

Agregue la concentración de analito más baja. La interacción entre las proteínas del analito y los objetivos inmovilizados en el chip altera la distribución de carga local de la superficie del grafeno, registrada como respuesta I: el cambio en el flujo de corriente entre los electrodos.

Después de la grabación, lavar con un tampón para disociar los analitos unidos. Repita el análisis con concentraciones de analito crecientes.

Un aumento gradual en la respuesta I con el aumento de las concentraciones de analito indica fuertes IBP entre el objetivo y el analito.

Comience mezclando volúmenes iguales de solución EDC y sulfo-NHS pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Coloque los chips biosensores suministrados por la empresa en una placa de Petri de vidrio con tapa ajustada. Se sugiere que todos los pasos de funcionalización involucrados en la activación del chip se realicen dentro de la placa de Petri. Aplique 50 microlitros de tampón MES de 1 molar al chip biosensor. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.

Luego, aspire el tampón y aplique 50 microlitros de solución EDC / sulfo-NHS inmediatamente al chip sensor. Cubra la placa de Petri e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución EDC / sulfo-NHS del chip y aplique 50 microlitros de tampón MES de 1 molar.

Aspire el tampón MES y enjuague el chip dos veces con 50 microlitros de 1x PBS. Aspire el PBS del chip y agregue la molécula objetivo Hsp90. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, aspire la solución que contiene la molécula objetivo y enjuague tres veces con 50 microlitros de 1x PBS.

Aspire la solución 1x PBS del chip y agregue 50 microlitros de la solución Quench 1. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución Quench 1 del chip y agregue 50 microlitros de la solución Quench 2. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, aspire la solución Quench 2 del chip y enjuague el chip cinco veces con 50 microlitros de 1X PBS dejando la última gota de PBS en el sensor.

Prepare la serie de dilución de analito para Cdc37 en el rango de concentración deseado. Diseñe el experimento para incluir al menos ocho concentraciones de analito diferentes para obtener una constante de disociación confiable o un valor de K_d, y prepare estas diferentes diluciones en el mismo tampón utilizado para la calibración y la proteína diana.

Coloque el chip con cuidado en el instrumento. Asegúrese de que el software esté encendido y que la luz LED se vuelva verde. A continuación, presione el módulo "Ejecutar experimento" en el software automatizado y elija "10 puntos con regeneración" o cualquier otro protocolo deseado. Complete los detalles, como el nombre del operador, el nombre del experimento, la fecha, el búfer de regeneración, el objetivo inmovilizado y el analito en solución. Presione el botón "Comenzar experimento" que se muestra en el software y siga las instrucciones que muestra el software automatizado.

Para realizar la calibración del instrumento, aspire la solución de PBS restante del chip y aplique 50 microlitros del tampón de calibración. Presione el botón 'Continuar' y espere cinco minutos hasta que finalice el paso de calibración. El software muestra el punto final determinado para el paso de calibración con una alarma de advertencia para el seguimiento.

A continuación, realice una asociación de analitos aspirando el tampón de calibración del chip y aplicando 50 microlitros de la concentración de analito más baja. Presione el botón 'Continuar' y espere cinco minutos hasta que finalice el paso de asociación. El software muestra el punto final para el paso de asociación con una alarma de advertencia para continuar.

Para realizar una disociación del analito, aspire la solución de analito del chip y aplique 50 microlitros del tampón de disociación. Presione el botón 'Continuar'. Después de la duración del paso de disociación, el software muestra el punto final del paso de disociación con una alarma de advertencia.

A continuación, realice la regeneración del chip aspirando la solución de disociación del chip y aplicando 50 microlitros del tampón de regeneración. Luego, presione el botón 'Continuar'. El paso de regeneración suele tardar aproximadamente 30 segundos en finalizar. Después de eso, el software muestra el punto final para el paso de regeneración con la alarma de advertencia para hacer un seguimiento.

Finalmente, para lavar el chip aspire la solución de regeneración del chip y aplique 50 microlitros del tampón de lavado. Aspira la solución del chip y repite esto cinco veces. Deje la última gota del tampón de lavado en el chip. Luego, presione el botón 'Continuar' y espere 30 segundos hasta que finalice la duración del paso de lavado en la pantalla del software.

Repita los pasos para cada concentración de analito utilizada. Los cinco pasos de la calibración, la asociación de analitos, la disociación, la regeneración y el lavado cinco veces constituyen un ciclo.