Imágenes FLIM-FRET para la caracterización de interacciones proteína-proteína en bacterias vivas

Para estudiar las interacciones proteína-proteína específicas en bacterias vivas utilizando microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida, FLIM, combinado con la transferencia de energía de resonancia de Förster, FRET, comienza con una suspensión bacteriana recombinante. Las bacterias expresan proteínas citoplasmáticas específicas involucradas en las vías metabólicas, marcadas con proteínas fluorescentes donantes y aceptoras adecuadas para FRET.

Detecte la suspensión bacteriana en una almohadilla de agarosa, que inmoviliza las bacterias en un portaobjetos de microscopio. Coloque un cubreobjetos en el portaobjetos y selle.

Coloque el portaobjetos en la platina de un microscopio de barrido invertido de excitación de dos fotones para microscopía FLIM-FRET. Use una lámpara de fluorescencia para seleccionar y escanear una región de interés en la monocapa bacteriana.

La interacción entre las proteínas citoplasmáticas expresadas acerca las proteínas fluorescentes donantes y aceptoras en la orientación adecuada. Tras la iluminación láser con una longitud de onda adecuada, la proteína fluorescente donante se excita.

La proximidad de las proteínas fluorescentes desencadena FRET, lo qu