Ensayo de agregación celular para detectar interacciones trans entre moléculas de adhesión celular

En el sistema nervioso, las interacciones transcelulares, interacciones entre moléculas específicas de adhesión de células sinápticas, proteínas transmembrana, en neuronas presinápticas y postsinápticas, forman un complejo en las sinapsis, mediando la señalización transsináptica.

Para detectar interacciones transcelulares entre moléculas de adhesión de células sinápticas expresadas en células renales embrionarias humanas a través de un ensayo de agregación celular, comience con suspensiones celulares transfectadas.

Una población celular transfectada expresa la molécula de adhesión celular presináptica deseada y la proteína fluorescente verde; la otra expresa la molécula de adhesión celular postsináptica específica y la proteína fluorescente roja. También se obtienen dos poblaciones celulares que expresan proteínas fluorescentes verdes y rojas.

Centrifugar las células. Vuelva a suspender las células en medios adecuados suplementados con iones de calcio. Mezcle las células transfectadas de ambas poblaciones por igual en un tubo. Repita para las otras poblaciones celulares.

Durante la incubación, los iones de calcio se unen a un sitio específico en la proteína presináptica expresada en una población celular. Esto aumenta la interacción de la proteína presináptica con el ligando postsináptico de la otra población celular, facilitando la unión, mediando la adhesión celular heterofílica entre estas células y dando lugar a la agregación celular.

Bajo un microscopio de fluorescencia, obtenga imágenes de las células utilizando canales adecuados, visualizando la fluorescencia verde y roja de las células. Procesa las imágenes.

No se observa agregación en las poblaciones celulares que expresan solo las proteínas fluorescentes. La agregación celular se visualiza como amarilla debido a la superposición entre las células fluorescentes verdes y rojas que expresan las moléculas de adhesión celular sináptica, lo que sugiere interacciones transcelulares entre las moléculas.

48 horas después de transfectar las células HEK293T, recolecte las células de la placa de 6 pocillos para su agregación. Primero, lave cada pozo dos veces con PBS. A continuación, para disociar suavemente las células, agregue 1 mililitro de EDTA de 10 milimolares a cada pocillo. Luego, incube la placa a 37 grados centígrados.

Después de cinco minutos de incubación, golpee suavemente la placa para separar las células y coseche cada pocillo en un tubo cónico separado de 15 mililitros. Centrifugar los tubos a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Mientras las células están peletizadas, prepare seis tubos de incubación etiquetando la parte superior de los tubos de microcentrífuga con las condiciones experimentales. Se deben usar todas las permutaciones de GFP y mCherry.

Retire los sobrenadantes de los tubos cónicos de 15 mililitros y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de medio. Con un hemocitómetro, cuente las células en cada tubo cónico. Luego, alícuotas 200,000 células de cada condición en el tubo de incubación apropiado para una mezcla uno a uno en un volumen total de 500 microlitros. Coloque los tubos de incubación en un rotador de tubos lento a temperatura ambiente.

Para evaluar la agregación, al inicio del estudio y nuevamente después de 60 minutos, pipetee 40 microlitros del tubo de incubación en un portaobjetos de microscopio cargado. La adquisición de la línea de base debe realizarse lo más rápido posible después de la adición de células al tubo de microcentrífuga.

Imagen del portaobjetos bajo fluorescencia en los canales verde y rojo. Para cada diapositiva, capture imágenes de tres campos de visión diferentes en un plano focal.