Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Comience el ensayo de ligadura de proximidad tomando nematodos disecados y fijándolos en un portaobjetos con sus células de la línea germinal expuestas. Estas células exhiben altos niveles de complejos ribonucleoproteicos que contienen proteínas de unión al ARN, RBP, asociadas con sus proteínas asociadas.

Superponga el portaobjetos con dos anticuerpos primarios que reconocen dos proteínas diana específicas: la RBP y su proteína asociada. Complemente el portaobjetos con dos tipos de anticuerpos secundarios específicos para sus respectivos anticuerpos primarios.

Cada anticuerpo secundario se conjuga con sondas de PLA, hebras de ADN con secuencias complementarias. Los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos primarios preadheridos, acercando las dos sondas de PLA.

Aplique el tampón de ligadura que contiene oligonucleótidos conectores, que se hibridan con las sondas PLA, y la enzima ligasa sella el espacio, generando ADN circular. Incube el portaobjetos con una solución de amplificación que contenga ADN polimerasa, dNTP y sondas detectoras conectadas a un fluoróforo rojo.

Usando el ADN circularizado como plantilla, la polimerasa inicia una amplificación de círculo rodante, gen