Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Comience el ensayo de ligadura de proximidad tomando nematodos disecados y fijándolos en un portaobjetos con sus células de la línea germinal expuestas. Estas células exhiben altos niveles de complejos ribonucleoproteicos que contienen proteínas de unión al ARN, RBP, asociadas con sus proteínas asociadas.

Superponga el portaobjetos con dos anticuerpos primarios que reconocen dos proteínas diana específicas: la RBP y su proteína asociada. Complemente el portaobjetos con dos tipos de anticuerpos secundarios específicos para sus respectivos anticuerpos primarios.

Cada anticuerpo secundario se conjuga con sondas de PLA, hebras de ADN con secuencias complementarias. Los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos primarios preadheridos, acercando las dos sondas de PLA.

Aplique el tampón de ligadura que contiene oligonucleótidos conectores, que se hibridan con las sondas PLA, y la enzima ligasa sella el espacio, generando ADN circular. Incube el portaobjetos con una solución de amplificación que contenga ADN polimerasa, dNTP y sondas detectoras conectadas a un fluoróforo rojo.

Usando el ADN circularizado como plantilla, la polimerasa inicia una amplificación de círculo rodante, generando muchas copias del ADN molde conectadas entre sí. El ADN amplificado permanece atado a la sonda PLA, lo que permite la localización de la interacción proteína-proteína.

Las sondas detectoras, que transportan oligonucleótidos monocatenarios cortos, interactúan con las regiones complementarias del ADN amplificado, formando dúplex e impartiendo señales de fluorescencia a los complejos de proteínas. Tome imágenes del portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia.

Observe si hay distintas manchas rojas dentro de la célula, lo que indica interacciones exitosas proteína-proteína.

Use el diluyente de anticuerpos para diluir los anticuerpos primarios. Aplique 40 microlitros de la solución de anticuerpo primario diluida por cada espacio de 14 por 14 milímetros en los portaobjetos. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda e incube durante la noche a 4 grados centígrados.

Por la mañana, lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco Coplin. Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital a 60 RPM. Coloque los portaobjetos sobre una toalla de papel para que el tampón de lavado se escurra del portaobjetos y limpie suavemente los bordes.

Prepare una solución de 40 microlitros que contenga sondas positivas y negativas. Agregue la solución a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante 1 hora a 37 grados centígrados. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco Coplin.

Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital a 60 RPM. Diluir el tampón de ligadura 1 a 5 con agua ultrapura. Utilice este tampón para diluir la ligasa 1 a 40 para preparar un material de trabajo de solución de ligadura. Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se escurra por los lados y limpie suavemente los bordes.

Agregue 40 microlitros de la solución de ligadura a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de lavar y secar los portaobjetos como se describió anteriormente, agregue 40 microlitros de solución de amplificación recién preparada y protegida de la luz a cada espacio de 14 por 14 milímetros.

Incube los portaobjetos en la cámara oscura húmeda durante 1 hora y 40 minutos a 37 grados centígrados. Lave los portaobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado B, y lave los portaobjetos una vez durante 1 minuto con 50 mililitros de 0,01x tampón de lavado B.

Después de dibujar el perímetro recubierto de epoxi del portaobjetos, agregue 10 microlitros de medio de montaje a cada muestra y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior, permitiendo que el medio de montaje se extienda. Pinte alrededor del borde del cubreobjetos con esmalte de uñas para sellar el cubreobjetos y deslizarlo. Evite mover el cubreobjetos. Deje que el esmalte de uñas se endurezca durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz.