Digestión de proteínas en membrana para preparar proteínas coinmunoprecipitadas para estudios de interacción

Para realizar la digestión en la membrana, tome una solución de complejos de proteínas coinmunoprecipitadas, cada uno de los cuales contiene una proteína diana recombinante marcada con GFP asociada con su proteína asociada.

Transfiera las proteínas a un tubo que contenga un difluoruro de polivinilideno prehumedecido, una membrana de PVDF e incube. La superficie hidrófila de la membrana de PVDF ayuda a transferir las proteínas a la membrana.

Transfiera la membrana que contiene proteínas a un tubo nuevo. Agregue un tampón que contenga un agente reductor para reducir los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína, lo que lleva a la desnaturalización de las proteínas individuales en los complejos sin alterar su interacción.

Reemplace esta solución con un reactivo alquilante, que alquila el grupo sulfhidrilo de ambas proteínas en los complejos y evita la reformación de enlaces disulfuro. Lave la membrana para eliminar cualquier exceso de reactivo.

Trate la membrana con un tampón que contenga tripsina, una enzima proteolítica. La tripsina escinde la proteína diana marcada con GFP y su proteína asociada en la terminal carboxilo de los residuos de arginina y lisina, liberando los péptidos más pequeños en el sobrenadante. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.

Lave la membrana con una solución ácida, disociando los péptidos unidos de la membrana, asegurando una extracción completa. Tire de las fracciones que contienen péptidos en un solo tubo. Desecar mediante secado al vacío.

Resuspender los residuos en una baja concentración de ácido fórmico, disolviendo los péptidos, que están listos para la identificación de la interacción proteína-proteína.

Para preparar la membrana, corte las membranas de PVDF en trozos de 3 milímetros por 3 milímetros con unas tijeras quirúrgicas que se limpiaron inmediatamente antes de su uso. Coloque los trozos de membrana sobre papel de aluminio y agregue de 2 a 5 microlitros de etanol a cada pieza. Antes de que las membranas estén completamente secas, agregue de 2 a 5 microlitros del eluyente proteico a cada pieza y séquelas al aire hasta que la superficie de la membrana se vuelva mate.

Luego, transfiera las membranas a tubos de 1,5 mililitros y guárdelas a 4 grados centígrados. Si se usa inmediatamente, agregue de 2 a 30 microlitros de etanol, lo que los hará hidrófilos. Retire el etanol con una pipeta. Pero antes de que las membranas se sequen, agregue completamente 200 microlitros de solución de reacción a base de DTT a cada tubo e incube a 56 grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación, reemplace la solución de reacción con 300 microlitros de solución de yodoacetamida e incube en la oscuridad durante 45 minutos. Luego, lave las membranas dos veces con agua destilada y una vez con acetonitrilo al 2% en vórtice durante al menos 10 segundos.

Trabajar con ditiotreitol y acetonitrilo puede ser extremadamente peligroso. Siempre se debe usar una máscara, anteojos y guantes al realizar el procedimiento de digestión en la membrana.

Prepare la tripsina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y agregue 100 microlitros de solución de reacción de tripsina a cada membrana. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados para la digestión.

Al día siguiente, transfiera la solución de reacción a un tubo limpio de 1,5 mililitros y agregue 100 microlitros de soluciones lavadas a la membrana. Incube la membrana a 60 grados centígrados durante dos horas.

Luego, recoja la solución lavada y mézclela con la solución de reacción. Agregue otros 100 microlitros de solución lavada a la membrana y sonique durante 10 minutos. Luego, recoja la solución lavada y mézclela con la solución de reacción. Cubra el tubo de ensayo con un trozo de película de laboratorio y haga pequeños agujeros en la película con una aguja.

Seque la solución con un concentrador de vacío y disuelva el residuo en 10 microlitros de ácido fórmico al 0,2%. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante tres minutos y transferir el sobrenadante a un tubo de muestra.

Analice la muestra utilizando un espectrómetro de masas conectado a un sistema de HPLC nano-LC.