Digestión de proteínas en membrana para preparar proteínas coinmunoprecipitadas para estudios de interacción

Para realizar la digestión en la membrana, tome una solución de complejos de proteínas coinmunoprecipitadas, cada uno de los cuales contiene una proteína diana recombinante marcada con GFP asociada con su proteína asociada.

Transfiera las proteínas a un tubo que contenga un difluoruro de polivinilideno prehumedecido, una membrana de PVDF e incube. La superficie hidrófila de la membrana de PVDF ayuda a transferir las proteínas a la membrana.

Transfiera la membrana que contiene proteínas a un tubo nuevo. Agregue un tampón que contenga un agente reductor para reducir los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína, lo que lleva a la desnaturalización de las proteínas individuales en los complejos sin alterar su interacción.

Reemplace esta solución con un reactivo alquilante, que alquila el grupo sulfhidrilo de ambas proteínas en los complejos y evita la reformación de enlaces disulfuro. Lave la membrana para eliminar cualquier exceso de reactivo.

Trate la membrana con un tampón que contenga tripsina, una enzima proteolítica. La tripsina escinde la proteína diana marcada con GFP y su proteína asociada en la terminal carboxilo de los residuos de arginina y lisina, liberando los pép