Ensayo de inmunoprecipitación para estudiar las interacciones entre receptores enzimáticos y células transfectadas

La muerte programada-1, PD-1, una proteína receptora de la superficie celular, contiene dos motivos citoplasmáticos de tirosina: el motivo inhibidor, ITIM, y el motivo de cambio, ITSM. La unión del ligando induce la fosforilación de ITIM e ITSM y el reclutamiento de la proteína tirosina fosfatasa SHP2 al dominio citoplasmático de PD-1, desencadenando una cascada de señalización aguas abajo.

Para estudiar las interacciones SHP2-PD-1 mediante un ensayo de coinmunoprecipitación, obtener un cultivo de células epiteliales adherentes. Estas células expresan proteína verde fluorescente, PD-1 de tipo salvaje marcada con GFP con ITIM e ITSM fosforilados. Obtener células epiteliales que expresen PD-1 mutante marcado con GFP, en el que las mutaciones ITIM o ITSM inhiben su fosforilación.

Agregue tampón de lisis que contenga detergente y ortovanadato de sodio. Los detergentes lisan las células, provocando la liberación de la proteína PD-1 marcada con GFP. Los bloques de ortovanadato de sodio liberaron fosfatasas, evitando así la desfosforilación de ITIM e ITSM.

Centrifugar el lisado. Transfiera el sobrenadante que contiene proteínas a tubos nuevos. Agregue perlas de agarosa recubiertas de anticuerpos anti-GFP. Las proteínas PD-1 marcadas con GFP se unen a los anticuerpos anti-GFP.

Incubar con la suspensión SHP2. El PD-1-GFP unido a perlas se une a SHP2 a través del ITIM y el ITSM fosforilados.

Agregue el tampón Laemmli y hierva para que los agentes reductores y detergentes en el tampón desnaturalicen los complejos de proteínas PD-1-GFP-SHP2. Centrifugar y recoger el sobrenadante que contiene los complejos proteicos desnaturalizados. Realice SDS-PAGE y western blot.

El PD-1 de tipo salvaje y mutado en ITIM interactúa con SHP2. Los mutantes ITSM no se unen a SHP2, lo que indica que la interacción PD1-SHP2 requiere ITSM fosforilada.

Al realizar la inmunoprecipitación, todos los pasos deben realizarse en hielo o a 4 grados centígrados. Complemente el tampón de lisis con inhibidores de la proteasa disolviendo una tableta de los inhibidores en 10 mililitros de tampón. Además, agregue 1 milimolar de ortovanadato de sodio al tampón que se utilizará en las placas transfectadas con PD1-GFP. Agregue 500 microlitros de tampón de lisis helado a las células, asegurándose de agregar el tampón de lisis que contiene el ortovanadato de sodio solo a las placas que contienen células transfectadas con PD1-GFP.

Use un raspador de células para quitar y recolectar inmediatamente las células de las placas. Transfiera los lisados a tubos fríos de 1,5 mililitros y gírelos a 0,005 veces g y a 4 grados centígrados durante 30 minutos. Para recolectar el sobrenadante post-núcleo de los lisados, gírelos hacia abajo a 10,000 veces g y 4 grados Celsius durante 10 minutos.

Transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos y deseche el gránulo. Guarde los sobrenadantes para el segundo conjunto de seis placas en hielo, para un análisis posterior de WCL.

Para comenzar a preparar perlas anti-GFP, agite suavemente la botella que contiene las perlas antes de abrirlas para evitar que se asiente. Retire 40 microlitros de las perlas anti-GFP de la suspensión por cada condición. Centrifugar a 500 veces g y 4 grados centígrados durante 3 minutos. Retire el sobrenadante para lavar las perlas, asegurándose de minimizar el contacto entre la pipeta y las perlas para evitar pérdidas.

Vuelva a suspender las perlas en 80 microlitros de tampón de lisis por muestra. Agregue las perlas lavadas directamente al lisado celular de las células que expresan PD1-GFP del primer conjunto de cuatro placas. Gire a 0,005 veces g durante 30 minutos a 4 grados Celsius para inmunoprecipitar las proteínas marcadas con GFP. Lave las perlas tres veces con 1 mililitro de tampón de lisis fría que no contenga ortovanadato para cada lavado. Luego, centrifugar a 2.500 veces g durante 10 segundos.

Divida el lisado del SHP2 activo del primer conjunto de placas en tres porciones iguales y agregue una porción a cada uno de los tres tubos que contienen las perlas lavadas que contienen PD1-GFP. Agregue 1/3 del volumen de lisado de las células no transfectadas al segundo tubo de las perlas PD1-GFP de tipo salvaje. Deseche los 2/3 restantes.

Incube las perlas durante 4 horas a 4 grados centígrados con una rotación suave a 0,005 veces g. Después de esto, lave las perlas dos veces, usando 1 mililitro de tampón de lisis fría para cada lavado. Agregue 80 microlitros de tampón de lisis a cada muestra, asegurando que el volumen total en cada tubo sea de 100 microlitros. Con una punta de pipeta cortada, pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Luego, transfiera 50 microlitros de cada tubo a dos tubos nuevos de 1,5 mililitros.

Primero, gire las cuentas a 2,000 veces g y 4 grados Celsius durante 30 segundos y retire el sobrenadante. Agregue 20 microlitros de 2x tampón Laemmli y hierva a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Usando un kit de BCA, mida la concentración de proteínas de los controles de entrada.

Transfiera 30 microlitros de la muestra más diluida a un nuevo tubo. Utilice el tampón de lisis para diluir el resto de los controles de entrada a la misma concentración que la muestra más diluida. Luego, transfiera 30 microlitros de cada uno de los controles de entrada diluidos a un nuevo tubo. Agregue volúmenes iguales de 2x tampón Laemmli a los lisados y hiérvalos a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Después de esto, gire las perlas a 2.000 veces g y 4 grados Celsius durante 30 segundos antes de realizar el análisis de Western blot como se describe en el protocolo de texto.