Ensayo de inmunoprecipitación para estudiar las interacciones entre receptores enzimáticos y células transfectadas

La muerte programada-1, PD-1, una proteína receptora de la superficie celular, contiene dos motivos citoplasmáticos de tirosina: el motivo inhibidor, ITIM, y el motivo de cambio, ITSM. La unión del ligando induce la fosforilación de ITIM e ITSM y el reclutamiento de la proteína tirosina fosfatasa SHP2 al dominio citoplasmático de PD-1, desencadenando una cascada de señalización aguas abajo.

Para estudiar las interacciones SHP2-PD-1 mediante un ensayo de coinmunoprecipitación, obtener un cultivo de células epiteliales adherentes. Estas células expresan proteína verde fluorescente, PD-1 de tipo salvaje marcada con GFP con ITIM e ITSM fosforilados. Obtener células epiteliales que expresen PD-1 mutante marcado con GFP, en el que las mutaciones ITIM o ITSM inhiben su fosforilación.

Agregue tampón de lisis que contenga detergente y ortovanadato de sodio. Los detergentes lisan las células, provocando la liberación de la proteína PD-1 marcada con GFP. Los bloques de ortovanadato de sodio liberaron fosfatasas, evitando así la desfosforilación de ITIM e ITSM.

Centrifugar el lisado. Transfiera el sobrenadante que contiene proteínas a tubos nuevos. Agregue perlas de agarosa recubiertas de anti