Ensayo de dos híbridos de levadura para determinar la autoasociación de proteínas en células de levadura

Para el ensayo de dos híbridos de levadura, tome una suspensión de células de levadura de crecimiento activo y genéticamente modificada que carece de la proteína activadora de la transcripción, GAL4. Estas células no pueden sintetizar leucina y triptófano.

Agregue un par de plásmidos de expresión: uno que codifica leucina y el dominio de unión al ADN, DNA-BD, de GAL4, fusionado con un dominio de proteína diana, y el otro que codifica triptófano y el dominio activador, AD, de GAL4 fusionado con otro dominio de la proteína diana.

Agregue un búfer que contenga agentes adecuados para la transformación. Choque térmico las células para causar la formación transitoria de poros, lo que facilita la absorción celular de plásmidos. Deje enfriar para volver a sellar los poros. Coloque las células en un medio de crecimiento selectivo que carezca de leucina y triptófano.

Las células transformadas que expresan dos proteínas híbridas sintetizan leucina y triptófano, sobreviven y forman colonias.

El ADN-BD fusionado con un dominio de proteína se une a la secuencia de ADN ascendente específica de la región promotora del gen que codifica la β-galactosidasa. Si los dominios de la proteína diana interactúan, la AD y el ADN-BD se acercan, lo que provoca la reconstitución de GAL4 funcional, lo que lleva a la expresión del gen de la β-galactosidasa.

Transfiera las colonias a papel de filtro. Congele y descongele las células para lisarlas y liberar β-galactosidasa. Coloque este papel de filtro sobre otro papel de filtro empapado con un sustrato de β-galactosidasa.

La β-galactosidasa liberada hidroliza el sustrato a galactosa y un producto inestable, que se dimeriza y se oxida formando un precipitado azul en el papel de filtro, lo que indica la interacción del dominio de la proteína diana.

En este ensayo de dos híbridos de levadura, las células de levadura en la fase de registro medio se utilizan para la transformación. Cosecha las células por centrifugación. Vuelva a suspender cada gránulo en cinco mililitros de agua estéril y agrupe las suspensiones celulares. Centrifugar la suspensión celular.

Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo de levadura en un mililitro de acetato de litio estéril 1X recién preparado y TE. Las células de levadura competentes deben utilizarse en el plazo de una hora a partir de la preparación. Prepare muestras de plásmidos mezclando ADN plásmido de cebo y diana con 100 microgramos de ADN portador de testículos de arenque.

A cada tubo de 1,5 mililitros, agregue 100 microlitros de la suspensión de levadura competente y 600 microlitros de acetato de litio 1X y solución de PEG, y vórtice durante unos 30 segundos. Incubar a 30 grados centígrados durante 30 minutos agitando. Agregue 80 microlitros de dimetilsulfóxido y mezcle bien mediante una inversión suave.

Choque térmico durante 15 minutos en un baño de agua a 42 grados centígrados mientras mezcla cada dos o tres minutos. Enfríe la suspensión celular en hielo durante dos minutos y luego centrifugue para recuperar la levadura. Resuspender cada gránulo celular en 100 microlitros de 1X TE. Coloque las células en placas medianas SD mínimas apropiadas para mantener la presión selectiva tanto en el cebo como en los plásmidos objetivo. Incube las placas boca abajo a 30 grados centígrados durante cuatro o cinco días.

Las colonias de levadura están listas para este ensayo cuando tienen unos dos milímetros de diámetro. Pipetee 2,5 mililitros de solución Z-Buffer y X-Gal recién preparada en una placa limpia de 100 milímetros y coloque un papel de filtro de celulosa en la placa. Coloque un nuevo papel de filtro sobre la superficie de la placa con las colonias de levadura a analizar. Use fórceps para frotar suavemente el papel de filtro sobre el plato y déjelo durante aproximadamente cinco minutos para que las colonias se adhieran.

Mientras usa el equipo de protección personal adecuado, levante con cuidado el papel de filtro y sumérjalo en un charco de nitrógeno líquido durante 30 segundos. Deje que el papel de filtro congelado se descongele a temperatura ambiente durante dos minutos. Coloque el papel de filtro con el lado de la colonia hacia arriba encima del papel de filtro previamente empapado dentro de la placa de 100 milímetros e incube a 30 grados centígrados hasta que aparezcan colonias azules.