Ensayo de purificación de afinidad en tándem para estudiar las interacciones proteína-proteína

La purificación por afinidad en tándem es un esquema de purificación secuencial para aislar complejos proteicos de células para estudiar las interacciones proteína-proteína.

Para comenzar, tome un cultivo celular que exprese proteínas de interés marcadas con epítopos. Las proteínas forman un complejo dentro de la célula. Una de las proteínas del complejo contiene una etiqueta estreptocócica, mientras que la otra está etiquetada con una etiqueta FLAG. Estas son pequeñas etiquetas de afinidad basadas en secuencias de péptidos sintéticos.

Retire el medio y agregue una solución detergente para lisar las células. Centrifugar para eliminar los restos celulares. Recolecte el sobrenadante que contiene el complejo de proteínas objetivo y otras proteínas celulares.

Agregue las perlas estreptocócicas (cuentas de agarosa recubiertas con estreptavidina) e incube. La etiqueta estreptocócica del complejo proteico se une a la estreptavidina. Centrifugar para recoger las perlas unidas al complejo proteico. Lavar para eliminar cualquier proteína celular contaminante.

Agregue un tampón de elución que contenga destiobitina, un derivado de la biotina, que desplaza el complejo proteico al unirse competitivamente a la estreptavidina. Centrifugar para obtener un sobrenadante que contenga el complejo proteico eluido.

Agregue perlas FLAG, perlas de agarosa recubiertas con anticuerpos anti-FLAG, e incube. La etiqueta FLAG del complejo proteico se une al anticuerpo. Centrifugar para recoger las perlas unidas al complejo proteico.

Agregue tampón de elución que contenga péptido FLAG libre. El péptido se une competitivamente al anticuerpo y desplaza el complejo proteico unido. Centrifugar para eluir el complejo proteico purificado.

Evaluar la presencia de ambas proteínas en el eluto para confirmar la interacción entre las proteínas de interés.

Después de que las mezclas de lisado celular y suspensión de perlas STREP se hayan incubado durante 2 horas, gírelas a 1.1500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Guarde el sobrenadante como "flujo STREP AP" y guárdelo a 4 grados centígrados.

Agregue 500 microlitros de STREP AP Wash Buffer 1 a las perlas. Nutar las perlas y la mezcla de tampón durante 5 minutos a 4 grados centígrados y centrifugar a 1.500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lave nuevamente con 500 microlitros de STREP AP Wash Buffer 1.

Después del tercer lavado, transfiera la solución de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para reducir el fondo de proteínas. Lave una cuarta vez con STREP AP Wash Buffer 1. Después del centrifugado, retire el sobrenadante y agregue 500 microlitros de Wash Buffer 2.

Equilibre las perlas invirtiendo los tubos y luego, gire hacia abajo a 1.500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante. Eluya la proteína de interés con 50 microlitros de tampón de elución STREP. Vórtice a 800 RPM durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Gire las cuentas a 1500 veces g durante 1 minuto a 4 grados centígrados. Recoge el sobrenadante. Esta fracción corresponde a la muestra de "elución STREP AP".

Guarde la fracción de perlas a 4 grados centígrados para una segunda elución. Alícuota del 10% de la elución de STREP AP para tinción de plata y/o western blot.

Para aumentar la cantidad de material de partida para la posterior inmunoprecipitación de FLAG, la primera y la segunda elución de STREP se pueden agrupar para una recuperación más eficiente de la elución de FLAG.

Comience este procedimiento utilizando una punta de pipeta de boca ancha para transferir la cantidad adecuada de solución de perlas FLAG a un tubo de microcentrífuga. Girar a 1.500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante y agregue 500 microlitros de tampón de lavado FLAG a las perlas.

Girar a 1.500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lave nuevamente con el tampón de lavado FLAG. Después del tercer lavado, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en el tampón de lavado FLAG hasta un volumen final de n por 16 microlitros, donde n es el número de muestras.

Agregue 16 microlitros de la suspensión de perlas FLAG a la elución STREP AP restante y nutate durante la noche a 4 grados centígrados. Después de una incubación nocturna de la suspensión de perlas FLAG y la elución STREP AP, proceda con la inmunoprecipitación FLAG.

Gire la suspensión de perlas FLAG a 1.500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Guarde el sobrenadante como el " flujo de FLAG IP" y guárdelo a 4 grados centígrados.

Agregue 500 microlitros de tampón de lavado FLAG a las perlas. Nutar durante 5 minutos a 4 grados centígrados y centrifugar a 1.500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lave nuevamente con 500 microlitros de tampón de lavado FLAG.

Después del tercer lavado, transfiera la solución de perlas de proteína a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para reducir el fondo. Lavar una cuarta vez con el tampón de lavado FLAG. Retire el sobrenadante del centrifugado final y agregue a las perlas 30 microlitros de tampón de lavado FLAG que contengan 200 nanogramos por microlitro de péptido FLAG. Vórtice a 800 RPM durante dos horas a 4 grados centígrados.

Después de dos horas, baje la suspensión a 1.500 veces g durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Coseche el sobrenadante y guárdelo a 4 grados centígrados como la "elución FLAG IP".