Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 6:34 min. • July 8th, 2025
La purificación por afinidad en tándem es un esquema de purificación secuencial para aislar complejos proteicos de células para estudiar las interacciones proteína-proteína.
Para comenzar, tome un cultivo celular que exprese proteínas de interés marcadas con epítopos. Las proteínas forman un complejo dentro de la célula. Una de las proteínas del complejo contiene una etiqueta estreptocócica, mientras que la otra está etiquetada con una etiqueta FLAG. Estas son pequeñas etiquetas de afinidad basadas en secuencias de péptidos sintéticos.
Retire el medio y agregue una solución detergente para lisar las células. Centrifugar para eliminar los restos celulares. Recolecte el sobrenadante que contiene el complejo de proteínas objetivo y otras proteínas celulares.
Agregue las perlas estreptocócicas (cuentas de agarosa recubiertas con estreptavidina) e incube. La etiqueta estreptocócica del complejo proteico se une a la estreptavidina. Centrifugar para recoger las perlas unidas al complejo proteico. Lavar para eliminar cualquier proteína celular contaminante.
Agregue un tampón de elución que contenga destiobitina, un derivado de la biotina, que desplaza el complejo proteico al unirse competi
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