Resonancia de plasmones de superficie para estudiar las interacciones biomoleculares mediante un chip sensor

Para realizar la resonancia de plasmones de superficie, o SPR, para estudiar las interacciones biomoleculares, comience con un chip sensor colocado sobre un detector SPR en una celda de flujo. Este chip sensor recubierto de metal tiene una capa de material de hidrogel depositado en la superficie del chip, lo que lo hace más adecuado para la inmovilización de proteínas.

Superponga el chip con péptidos virales, que interactúan con el hidrogel y se inmovilizan en la superficie. Lavar con una solución alcalina de enfriamiento que evita interacciones proteicas no específicas.

Luz polarizada directa sobre el chip. En el ángulo de resonancia, los electrones metálicos absorben esta luz y resuenan, reduciendo la intensidad de la luz reflejada en el ángulo reflejado correspondiente.

El fotodetector recoge esta luz reflejada y el procesador convierte esta señal en línea de base, generando un sensorgrama, un gráfico que representa la respuesta del sensor en función del tiempo.

Fluya una solución de agente antiviral en la celda de flujo. Durante el flujo, los agentes antivirales interactúan con los péptidos virales inmovilizados en el chip. Esta asociación cambia el índice de refracción, lo que altera el ángulo y la intensidad de la luz reflejada, lo que en última instancia da como resultado una respuesta del sensor.

Agregue un tampón de lavado de alta fuerza iónica que interrumpa la interacción entre las dos moléculas, lo que lleva a su disociación y disminuye la respuesta del sensor.

Analizar la forma del sensorgrama y evaluar la asociación y disociación de las dos moléculas cruciales en las interacciones biomoleculares.

Para el sistema SPR de doble canal, use HBS-EP+ como tampón de funcionamiento, ácido clorhídrico de glicina 10 milimolares de pH 1.5 a 1.6 como tampón de regeneración y encienda el desgasificador del instrumento, el muestreador automático y la bomba. Luego, lave todo el sistema con agua doble destilada durante 1 hora.

A continuación, deje caer aceite de inmersión en el detector y monte un chip sensor de vidrio recubierto con una fina película de oro y, en la parte superior, funcionalizado con hidrogel de carboximetildextrano directamente en el detector debajo de la celda de flujo de tres puertos. Luego, corrija la configuración tirando hacia abajo del manejo.

Para inmovilizar los ligandos proteicos en chips sensores, abra una tabla de ejecución haciendo clic en Formulario en la barra de menú y Ejecutar editor de tablas en el software SPRAutoLink integrado. Luego, elija y haga clic en BASIC_Immobilization de la lista de tablas de ejecución disponibles y siga los pasos del procedimiento experimental en la pantalla de la computadora.

A continuación, haga clic en Editor de conjuntos de muestras en la sección Formulario para rellenar la lista de reactivos de dos gradillas colocadas en el muestreador automático para su posterior análisis. Haga clic en Autosampler Sampler Direct Control como herramienta en la barra de menú para llevar los racks hacia adelante o hacia casa, y elija 4 grados Celsius como temperatura de funcionamiento.

Inicie la bomba para infundir agua de doble destilación haciendo clic en Herramientas y "Control directo de la bomba ", y registre datos haciendo clic en "Control directo del instrumento SPR" y, cada vez, comience en la ventana recién aparecida. Después de añadir los reactivos de acoplamiento en viales de 300 microlitros, colóquelos en las gradillas del muestreador automático e inicie la tabla de ejecución haciendo clic en Ejecutar.

Para la interacción proteína-proteína simple después de rellenar la bomba a 25,000 microlitros por minuto, realice un ajuste de línea de base durante 30 segundos. Permita el ajuste de línea de base posterior con agua bidestilada durante 1,5 minutos antes de enfriar la superficie de la viruta activada con clorhidrato de etanolamina de 1 molar, pH 8,5. A continuación, cambie los tubos del muestreador de líquidos al desgasificador de agua bidestilada a la botella con HBS-EP+.

Haga clic en Formulario, desplácese hacia abajo y cambie a "Posprocesamiento" haciendo clic en este modo de operación. A continuación, haga clic en Añadir para seleccionar las curvas de enlace generadas a lo largo del tiempo en el formulario de trazado de datos para cada celda de flujo y exporte la superposición como un archivo de depuración. A continuación, haga clic en Archivo para abrir las opciones de guardado de archivos y obtener curvas de respuesta alineando las curvas izquierda y derecha y restando las señales del segundo canal de referencia de las del canal ligando.