JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 6:05 min • July 8th, 2025
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear, o RMN, permite la detección de la interacción proteína-proteína a nivel atómico.
Para estudiar las interacciones entre proteínas globulares y helicoidales, marque proteínas globulares purificadas de tipo salvaje o mutantes con 15N, un isótopo de nitrógeno. En un tubo de RMN, mezcle las proteínas globulares y helicoidales marcadas sin marcar en un disolvente que contenga un patrón de RMN. Inserte el tubo en el espectrómetro de RMN.
Los imanes del espectrómetro generan un fuerte campo magnético, alineando los 15núcleos de proteínas globulares marcados con N paralelos al campo. Un pulso de radiofrecuencia, o RF, excita los 15núcleos N para alinearlos antiparalelos al campo.
La frecuencia de pulso requerida para la transición de 15núcleos N entre los dos estados define la frecuencia de resonancia. La normalización de la frecuencia de resonancia de 15N al estándar de RMN mide el cambio químico de 15N.
El campo magnético se ajusta para alinear los núcleos 1H, unidos a 15N, paralelos al campo. Se ajustan los pulsos de RF y se registra el desplazamiento químico de 1H.
Durante las interacciones de proteínas, el entorno químico que rodea a los residuos de aminoácidos que interactúan cambia, alterando los enlaces químicos 15 N-1H y los cambios químicos correspondientes. Grafique los espectrosde RMN 15 N-1H.
Sin proteínas helicoidales, las proteínas globulares de tipo salvaje exhiben picos espectrales bien resueltos. Cuando interactúan las proteínas globulares helicoidales y de tipo salvaje, el pico espectral se reduce. Por el contrario, la incubación de proteínas helicoidales con proteínas globulares mutantes da como resultado la reaparición de los picos espectrales, lo que indica que no hay interacción entre ellos.
Encienda el flujo de aire con el comando de expulsión "ej". Esto hará que la muestra salga del imán. Ahora, coloque la muestra dentro de una rueda giratoria encima del imán en la abertura. Insertar con el comando "ij". Espere hasta que la muestra se asiente dentro del imán antes de continuar.
Cree un nuevo conjunto de datos usando el comando "edc" y cargue los parámetros de RMN de protones estándar seleccionando el experimento "ZGPR". Rellene los campos nombre, número de experimento y número de carpeta de datos procesados.
Seleccione el disolvente en el campo "Establecer disolvente" y haga clic en "Ejecutar 'getprosol'" para leer el cabezal de la sonda estándar y los parámetros dependientes del disolvente. Bloquee la muestra al disolvente deuterado mediante el comando "Bloquear" y espere hasta que termine de barrer y logre el bloqueo.
Corrija la frecuencia de resonancia del imán afinando la muestra usando el comando de sintonización automática "atma". Supervise la curva de bamboleo hasta que se complete el ajuste automático.
Cuña el campo magnético usando "TOPSHIM". El Shimming realiza ajustes al campo magnético para lograr uniformidad alrededor de la muestra. Es una buena práctica almacenar los mismos valores con el comando "wsh" y leerlos usando "rsh" antes de topshim si usa las mismas muestras o similares.
Ahora, ajuste la ganancia del receptor con el comando "rga" para lograr la máxima relación señal-ruido. Coloque el centro del espectro en el desplazamiento de resonancia del agua y establezca el pulso de protones de 90 grados a alta potencia usando "calibo1p1".
Recopile el espectro de protones usando el comando "zg" de Zero Go y procese con "efp". Esto incluye la multiplicación exponencial, la desintegración por inducción libre que incorpora el ensanchamiento de líneas, la transformación de Fourier de FID y "pk" para aplicar la corrección de fase.
Aplique la corrección automática de fase "apk" y la corrección automática de línea de base "absn" utilizando la opción de polinomio sin integración. Cree un nuevo conjunto de datos para el experimento SOFAST HMBC seleccionando "SFHMQC3GPPH" en el experimento.
Copie los P1 y O1 optimizados del espectro de protones y rellene los pulsos dependientes de P1 utilizando el comando "getprosol 1H p1 plw1" donde P1 es el valor optimizado de P1 y plw1 es el nivel de potencia para P1. Ahora, optimice la constante CNST54 para establecer el desplazamiento del desplazamiento químico de la amida. Además, optimice CNST55 para definir el ancho de banda con el fin de abarcar las regiones espectrales de interés, lo que permite optimizar la ganancia del receptor.
Para seleccionar estos parámetros, extraiga el primer FID del espectro bidimensional y busque la señal observada para definirlos. Además, varíe el retardo de relajación, el número de escaneos y los escaneos ficticios para obtener una sensibilidad de señal aceptable con el comando "gs", que permite que go and scan monitoree la calidad de los datos en tiempo real. Finalmente, registre los espectros usando Zero Go "zg".