Uso de la visualización de fagos para seleccionar proteínas con alta afinidad con una proteína objetivo

Comience la visualización de fagos agregando una biblioteca de fagos a los pocillos de una placa de pocillos múltiples, recubierta con proteína diana. La biblioteca de fagos contiene fagos modificados genéticamente, cada uno de los cuales muestra una variante de proteína individual fusionada con una proteína de recubrimiento en su superficie. Incubar, permitiendo que el fago y las proteínas diana interactúen.

Los fagos con proteínas con una alta afinidad de proteína diana se unen a la proteína diana. Lavar con un tampón, eliminando los fagos no unidos. Agregue una solución ácida, interrumpiendo las interacciones entre los fagos y las proteínas objetivo, liberando fagos en la solución. Neutralice el pH de la solución con un tampón, manteniendo la estabilidad del fago.

Transfiera los fagos a un tubo nuevo. Incubar con una solución bloqueadora que contenga proteínas, evitando interacciones inespecíficas.

Transfiera los fagos a una suspensión de E. coli que se divide activamente, infectando bacterias e iniciando el ciclo de replicación de fagos. Complemente con fagos auxiliares, que infectan las bacterias, proporcionando las proteínas de la cubierta necesarias para empaquetar los fagos de la progenie. Transfiera la suspensión a un medio selectivo, permitiendo el crecimiento de bacterias infectadas por fagos.

Los fagos de la progenie finalmente se liberan en el medio. Centrífuga. Recoge el sobrenadante que contiene fagos. Agregue una solución de precipitación, concentrando las partículas del fago. Centrífuga. Vuelva a suspender el gránulo de fago en un tampón, obteniendo una suspensión homogénea.

Realice rondas posteriores de selección de fagos; repita la unión de la proteína diana del fago, la elución con un paso de rigor de lavado de tampón aumentado y los pasos de amplificación y centrifugación, lo que da como resultado el enriquecimiento de grupos de fagos que muestran proteínas con alta afinidad con la proteína diana.

Descongele la biblioteca de fagos en hielo. Luego, dilúyalo a 100 veces la diversidad de bibliotecas en PBS. Agregue la solución de polietilenglicol / cloruro de sodio a 1/5 del volumen de la biblioteca diluida e incube la solución en hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifugar la solución a 11.000 veces g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y centrifugue durante otros dos minutos para extraer el sobrenadante restante y concentrar la pastilla de fagos.

Vuelva a suspender suavemente el gránulo de fago en un mililitro de tampón PBT por proteína diana que se analizará, normalmente, cuatro en total. Agregue 100 microlitros de biblioteca de fagos a cada pocillo recubierto en la placa de control. Incube a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.

Deseche el tampón PB de la placa de destino en el fregadero y seque la placa con toallas de papel. Transfiera los 100 microlitros de la biblioteca de fagos en la placa de control a cada pocillo recubierto de la placa de destino. Incube a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.

A continuación, retire la biblioteca de fagos de la placa y lave los pocillos recubiertos cuatro veces con tampón PT. Invierta el plato y golpee una toalla de papel para eliminar las últimas gotas de tampón. Agregue 100 microlitros de ácido clorhídrico 0.1 molar a cada pocillo recubierto para eluir el fago. Incube la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación orbital de 300 RPM.

Después de eso, neutralice el pH agregando 12,5 microlitros de clorhidrato de Tris molar de pH 11 a cada pocillo recubierto. Transfiera el fago eluido de los ocho pocillos a un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Pipetee hacia arriba y hacia abajo durante la transferencia para que las soluciones sean homogéneas y aspire todo el líquido de los pocillos. Agregue un 10% de BSA al fago eluido para obtener la concentración final del 1%.

Almacene el tubo de microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Esta es la salida de la primera ronda. Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección inoculando cinco mililitros de cultivo de semillas de 2YT / tetraciclina con una colonia aislada de E. coli de una placa de agar.

Incube durante la noche a 37 grados Celsius con agitación orbital de 200 RPM. Diluya la proteína diana en los tubos redondos dos y tres con una cantidad adecuada de PBS. Tome la mitad del contenido de los tubos de las rondas dos y tres y cubra cuatro pocillos por proteína objetivo en una placa de unión de 96 pocillos para la siguiente ronda.

A continuación, use la mitad de la salida redonda para inocular tres mililitros de células de fase logarítmica media. Incubarlo a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación orbital de 200 RPM. Agregue el fago auxiliar M13KO7 a una concentración final de 10 mil millones de pfu por mililitro. Incubarlo nuevamente a 37 grados Celsius durante una hora con agitación orbital de 200 RPM.

Después de una hora, transfiera los tres mililitros completos de cultivo a 30 mililitros de solución de 2YT / carbenicilina / kanamicina. Crece durante la noche a 37 grados Celsius con temblores orbitales de 200 RPM.