Microscopía de localización fotoactivada acoplada a la complementación de fluorescencia bimolecular

En su forma activa, el monómero de Ras asociado a la membrana plasmática, una proteína de unión a nucleótidos de guanina, recluta Raf, una proteína quinasa inactiva que se une a Ras a través de su dominio de unión a Ras.

Esta unión da como resultado un complejo Ras-Raf funcional que desencadena el proceso de señalización aguas abajo.

Para visualizar la interacción intracelular Ras-Raf, comience con una suspensión de células genéticamente modificadas en un portaobjetos bien calibrado. Estas células expresan dos proteínas de fusión no fluorescentes: una comprende Ras unida a la mitad de un fluoróforo fotoactivable a través de su N-terminal, y la otra es Raf fusionada con la otra mitad del mismo fluoróforo en su C-terminal.

Dentro de las células, las proteínas de fusión que contienen Ras se acoplan a la membrana plasmática e interactúan con las proteínas de fusión que contienen Raf, reconstituyendo los fragmentos de la proteína fluorescente en un fluoróforo fotoactivable completo. La ausencia de unión de Ras y Raf mantiene separadas las dos mitades de fluoróforos.

Agregue un reactivo fijador al portaobjetos. Las moléculas fijadoras forman enlaces cruzados con las proteínas y estabilizan los complejos proteicos.

Retire el reactivo fijador y agregue un tampón de imágenes. Coloque el portaobjetos debajo de un microscopio de fluorescencia para microscopía de localización fotoactivada, PALM. Ilumine las células con un láser de alta intensidad, activando un pequeño subconjunto de moléculas fluorescentes.

Visualice la fluorescencia de origen aleatorio producida por cada complejo Ras-Raf de tamaño nanométrico y marcado con fluoróforo, visible como puntos de fluorescencia de alta resolución.

Para preparar una muestra para la obtención de imágenes, coloque aproximadamente 5,5 x 10⁴ células de expresión estable por pocillo de un portaobjetos de cámara con fondo de vidrio de 8 pocillos, en 350 microlitros de DMEM sin rojo de fenol. Use paraformaldehído fresco con glutaraldehído para fijar las células y, después de reemplazar el fijador con PBS o tampón de imágenes, divida partículas de oro de 100 nanómetros en vórtice y agregue 35 microlitros por pocillo para rastrear la deriva de la etapa durante la obtención de imágenes.

Acérquese al microscopio y encienda los láseres de 405 y 561 nanómetros. Manteniendo las persianas cerradas en este punto, asegúrese de que el espejo dicroico de 561 nanómetros y el filtro de muesca estén en su lugar. Abra el software de adquisición de imágenes.

Encienda la cámara EMCCD y deje que se enfríe, y ajuste el tiempo de exposición a 100 milisegundos y la ganancia EMCCD a un valor apropiado. Agregue aceite de inmersión al objetivo y asegure la muestra en la platina del microscopio. A continuación, con un campo claro o con el láser de 561 nanómetros, enfoque la muestra.

Para obtener imágenes de Ras y otras proteínas de membrana, use un objetivo TIRF apocromático de 60X con una apertura numérica de 1.49 y lleve el microscopio a la configuración TIRF.

Ajuste el láser de excitación para que esté descentrado al golpear la abertura posterior del objetivo TIRF, lo que hará que el láser se desvíe al llegar a la interfaz del búfer de cubreobjetos. Siga ajustando la posición incidente del láser hasta que se alcance el ángulo crítico y el láser se refleje hacia atrás.

Busque una celda para obtener una imagen con varias partículas de oro a la vista. Luego, establezca una región de interés que encierre la celda o una región de ella y las partículas de oro.

En caso de que ya se esté produciendo una activación suficiente debido a los altos niveles de expresión, comience la adquisición con el láser de 405 nanómetros apagado y el láser de 561 encendido. De lo contrario, encienda el láser de 405 nanómetros en la configuración de potencia más baja de fábrica y auméntelo gradualmente hasta que haya decenas de moléculas por cuadro más o menos que las moléculas individuales estén bien separadas.

A medida que continúa la adquisición de datos, aumente gradualmente la potencia del láser de 405 nanómetros para mantener la densidad del punto aproximadamente constante. Continúe con la adquisición de imágenes hasta que la alta potencia 405 no inicie más eventos de activación.