Microscopía de localización fotoactivada acoplada a la complementación de fluorescencia bimolecular

En su forma activa, el monómero de Ras asociado a la membrana plasmática, una proteína de unión a nucleótidos de guanina, recluta Raf, una proteína quinasa inactiva que se une a Ras a través de su dominio de unión a Ras.

Esta unión da como resultado un complejo Ras-Raf funcional que desencadena el proceso de señalización aguas abajo.

Para visualizar la interacción intracelular Ras-Raf, comience con una suspensión de células genéticamente modificadas en un portaobjetos bien calibrado. Estas células expresan dos proteínas de fusión no fluorescentes: una comprende Ras unida a la mitad de un fluoróforo fotoactivable a través de su N-terminal, y la otra es Raf fusionada con la otra mitad del mismo fluoróforo en su C-terminal.

Dentro de las células, las proteínas de fusión que contienen Ras se acoplan a la membrana plasmática e interactúan con las proteínas de fusión que contienen Raf, reconstituyendo los fragmentos de la proteína fluorescente en un fluoróforo fotoactivable completo. La ausencia de unión de Ras y Raf mantiene separadas las dos mitades de fluoróforos.

Agregue un reactivo fijador al portaobjetos. Las moléculas fijadoras forman enlaces cruzados con las proteínas y estabiliz