Inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas diana en el ADN genómico

Para identificar los sitios de unión de una proteína diana en el ADN, comience con células precursoras de oligodendrocitos que contengan una proteína diana reticulada a secuencias específicas de ADN en la cromatina.

Tratar las células con un tampón de lisis que contenga inhibidores de la proteasa. El tampón de lisis lisa las células, mientras que los inhibidores inactivan las proteasas para conservar la integridad de los complejos proteína-cromatina.

Sonicar el contenido para cortar los complejos en fragmentos de cromatina más pequeños, y algunos retienen la proteína objetivo.

Centrifugar para granular los componentes celulares y transferir el sobrenadante que contiene fragmentos de cromatina a un tubo nuevo. Incubar con anticuerpos anti-objetivo que se unen específicamente a la proteína diana en los fragmentos de cromatina.

Complemente el tubo con perlas magnéticas recubiertas de proteína A que se unen a la región Fc de los anticuerpos preunidos. Aplique un campo magnético para precipitar selectivamente las proteínas diana unidas a anticuerpos complejadas con fragmentos de cromatina.

Trate los complejos de perlas con un tampón de elución con alto contenido de sal para interrumpir las interacciones proteína-cromatina y liberar el ADN desnudo sin proteínas asociadas.

Use solventes orgánicos para extraer el ADN. Agregue un tampón de amplificación y ejecute una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los fragmentos de ADN. Después de la amplificación, analizar la secuencia de ADN.

Compare la secuencia de los productos amplificados con la secuencia de ADN genómico de la célula. Encuentre la región con una coincidencia de secuencia entre el fragmento y el ADN genómico, correlacionándose con los sitios de unión de proteínas.

Después de contar en un hemocitómetro, agregue 20,000 OPC purificados en 1 mililitro de medio de cultivo celular OPC para la reacción ChIP. Luego, agregue 27 microlitros de formaldehído al 36,5% a temperatura ambiente durante 10 minutos. Esto arreglará las células.

Después de 10 minutos, agregue 50 microlitros de glicina molar 2.5 en las células fijas durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agregar la glicina detendrá la reticulación ADN-proteína. Luego, lave las células reticuladas con 1 mililitro de tampón HBSS con un cóctel de inhibidores de proteasa. A continuación, centrifugue las células en una máquina centrífuga preenfriada a 300 veces g a 4 grados centígrados.

Después de reticular los OPC purificados, las celdas reticuladas deben lavarse con una solución de HBSS helada y los pasos restantes de ChIP deben llevarse a cabo a 4 grados. De lo contrario, el anticuerpo no puede precipitar el ADN genómico correctamente.

Luego, agregue 25 microlitros de tampón de lisis completo al gránulo celular y déjelo en hielo durante 5 minutos. A continuación, pipetee 75 microlitros de tampón HBSS helado con cóctel inhibidor de proteasa. A continuación, cizallar la cromatina del lisado celular en un sistema de sonicación preenfriado con cinco ciclos de 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado.

Una vez cortada la cromatina, centrifugar el lisado celular a 14.000 veces g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Al final de la centrifugación, recoja el sobrenadante. Luego, diluya 100 microlitros de la cromatina cortada con un volumen igual del tampón ChIP helado con inhibidor de proteasa.

A continuación, agregue 1 microlitro de anticuerpo anti-olig2 de conejo a 180 microlitros de cromatina cortada diluida. Incube los tubos en una rueda giratoria durante 16 horas a 4 grados centígrados a 40 revoluciones por minuto. A continuación, agregue 10 microlitros de perlas recubiertas de proteína A prelavadas al tubo de reacción ChIP en una cámara frigorífica. Nuevamente, incube los tubos ChIP a 4 grados Celsius durante otras 2 horas en la rueda giratoria.

Después de 2 horas, deje el tubo de reacción ChIP en la gradilla magnética durante un minuto. Luego, lave el gránulo de perlas con 100 microlitros de cuatro tampones de lavado cada uno durante 4 minutos en una rueda giratoria a 4 grados centígrados. Luego, agregue 200 microlitros de tampón de elución al gránulo de perlas. Incube el tubo de reacción a 65 grados centígrados durante 4 horas.

Una vez que se desnaturaliza el ADN bicatenario, desfosforile el extremo 3 primo del ADN monocatenario agregando fosfatasa alcalina de camarón. Luego, agregue la cola de poli (T) al ADN monocatenario usando desoxinucleotidiltransferasa terminal. A continuación, recocer el cebador de poli-(dA) de ADN a la plantilla de ADN monocatenario. A continuación, amplíe la biblioteca de secuencias ChIP utilizando cebadores directos e inversos para la indexación.

El número de ciclos de PCR para la preparación de la biblioteca depende de la cantidad de ADN inicial. Una buena preparación de la biblioteca requiere una cuantificación precisa de la cantidad de ADN de entrada. Demasiados o muy pocos ciclos de PCR pueden influir en la concentración de la biblioteca, así como en la complejidad, lo que lleva a artefactos de PCR.

Utilice perlas paramagnéticas para seleccionar los fragmentos que van de 250 a 500 pares de bases de la biblioteca de secuencias ChIP amplificadas por PCR. Utilice un dispositivo de electroforesis capilar ChIP microfluídico para examinar la calidad de la biblioteca de secuencias ChIP seleccionada.