Anisotropía de fluorescencia para determinar la afinidad de unión entre el factor de transcripción y el ADN
JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 5:00 min • July 8th, 2025
El factor de transcripción, TF, es una proteína que se une a la región específica del ADN de un gen y regula la transcripción.
Para medir las interacciones TF-ADN por anisotropía de fluorescencia, tome una placa de pocillos múltiples. Agregue gel fundido mezclado con una solución tamponada, que contenga concentraciones conocidas de ADN de referencia marcado con fluoróforo que comprende un sitio de unión a TF y una mayor concentración de moléculas de TF, al pocillo e incube.
A medida que el ADN de referencia marcado se distribuye en el gel, una mayor concentración de moléculas de TF garantiza que todas las moléculas de ADN estén unidas a TF. Agregue una solución tamponada que contenga ADN competidor no marcado con una mutación de un solo punto.
Analice el gel de la placa mediante microscopía de anisotropía de fluorescencia de alto rendimiento.
La luz polarizada excita el fluoróforo de referencia unido al ADN, que se reorienta debido a la caída molecular y emite luz despolarizada multidireccional, un fenómeno llamado anisotropía de fluorescencia, FA.
Al unirse a TF, el peso molecular del fluoróforo unido al ADN de referencia aumenta y cae más lentamente, emitiendo más luz polarizada que aumenta la FA.
El ADN de la competencia no marcado se difunde a través de la matriz de gel con el tiempo, formando un gradiente de concentración de alto a bajo. Una mayor concentración de ADN competidor no marcado desplaza el ADN de referencia marcado y se une a TF. Los oligómeros de referencia etiquetados liberados caen más rápido, disminuyendo la FA.
Grafique el FA del fluoróforo y el gradiente de concentración del ADN de la competencia a lo largo del tiempo, que disminuye a medida que más moléculas de ADN de la competencia desplazan el ADN de referencia.
Para preparar los pocillos de titulación y calibración de una placa de 96 pocillos, transfiera dos alícuotas de gel a un agitador de incubadora a 75 grados Celsius.
Para cada pocillo de titulación, agregue 1,4 nanomoles de ADN de referencia, proteína del factor de transcripción a una concentración final de 20 a 60 nanomoles, DTT 0,2 milimolares y el tampón de unión a 240 microlitros del gel derretido.
Mezcle bien invirtiendo y agitando el tubo. A continuación, pipetee lentamente 200 microlitros por pocillo del gel que contiene ADN en los pocillos de titulación designados de una placa de 96 pocillos. Para cada pozo de calibración, agregue 5 nanomoles de tinte azul del Nilo a 240 microlitros del gel derretido. Para evitar las burbujas de aire, pipetee lentamente 200 microlitros de la solución de gel que contiene colorante en cinco o seis pocillos de la placa de 96 pocillos.
Coloque el gel sobre una superficie perfectamente horizontal e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente y otros 10 minutos a 4 grados centígrados. Utilice un lector de placas multipocillos para comprobar la homogeneidad de los niveles de altura del gel en diferentes pocillos de la placa.
Para preparar la solución de ADN de la competencia, primero combine el ADN de referencia marcado, la proteína y el tampón de unión concentrado tres veces. Luego, mezcle 20 microlitros de la solución con 40 microlitros de cada una de las soluciones de ADN recocido de la competencia.
Para cada pocillo de calibración, combine las cantidades apropiadas de una de las soluciones de ADN de la competencia recocidas y el tampón aglutinante concentrado tres veces que contiene una solución de colorante azul del Nilo de 15 milimolares. Finalmente, agregue 50 microlitros de las soluciones mixtas de la competencia sobre los geles de la manera más simultánea posible.
Para comenzar la adquisición de imágenes, coloque la placa de 96 pocillos en la platina del microscopio. Luego, tome series de tiempo de imágenes de pila z de pocillos hasta que se desvincule completamente la proteína del ADN de referencia.
Realice el ensayo de titulación de acuerdo con el manuscrito. A continuación, utilice el software HiP-FA para crear curvas de valoración para secuencias individuales de la competencia. A continuación, haga clic en el botón "Exportar" para obtener la constante de disociación y la concentración de la proteína activa en cada pocillo de titulación.
Descripción general
Este artículo describe un método para medir las interacciones entre factores de transcripción (TF) y ADN utilizando anisotropía de fluorescencia. El protocolo consiste en preparar una placa de múltiples pocillos con gel que contiene ADN marcado con fluoróforo y el factor de transcripción, seguido de un análisis mediante microscopía de anisotropía de fluorescencia de alto rendimiento.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- bioquímica
- biología molecular
- microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- Los factores de transcripción son proteínas que regulan la expresión génica al unirse a regiones específicas del ADN.
- La anisotropía de fluorescencia es una técnica utilizada para estudiar interacciones moleculares.
- Comprender las interacciones entre factores de transcripción y ADN es fundamental para obtener conocimientos sobre la regulación génica.
- Este método permite el monitoreo en tiempo real de estas interacciones.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para cuantificar las interacciones de unión entre TF y ADN.
- Utilizar la anisotropía de fluorescencia para medir los cambios en la dinámica molecular tras la unión.
- Proporcionar un protocolo detallado para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Preparación de una placa de múltiples pocillos con gel que contiene ADN de referencia y factor de transcripción (TF).
- Incorporación de ADN competidor para evaluar la dinámica de unión.
- Uso de microscopía de anisotropía de fluorescencia de alto rendimiento para el análisis.
- Análisis de datos mediante el software HiP-FA para generar curvas de titulación.
Resultados principales
- Medición exitosa de las interacciones TF-ADN mediante anisotropía de fluorescencia.
- Demostración del impacto del ADN competidor sobre la dinámica de unión.
- Generación de curvas de titulación que indican constantes de disociación.
- Validación de la eficacia del método para el monitoreo en tiempo real.
Conclusiones
- El método desarrollado proporciona un enfoque robusto para el estudio de las interacciones entre factores de transcripción y ADN.
- La anisotropía de fluorescencia es eficaz para el análisis en tiempo real de la unión molecular.
- Este protocolo puede adaptarse para diversos factores de transcripción y secuencias de ADN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de la afinidad de unión entre factores de transcripción y ADN es fundamental para la validación de dianas en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos, ya que permite reducir el riesgo mecanicista de las hipótesis sobre la regulación génica. La anisotropía de fluorescencia proporciona una lectura en fase acuosa basada en marcado que facilita el desarrollo de ensayos para campañas de cribado dirigidas a las interacciones proteína-ADN. Este método ofrece constantes de disociación cuantitativas que aportan información para la identificación de compuestos iniciales y para la confianza predictiva en moduladores transcripcionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide la afinidad de unión entre factores de transcripción y secuencias específicas de ADN para validar hipótesis terapéuticas.
- Valor operativo: Utiliza titulación competitiva para evaluar la especificidad y el potencial de desplazamiento de moléculas candidatas.
- Valor predictivo: Genera curvas de titulación y constantes de disociación que respaldan la confianza en el blanco y su priorización.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Permite la monitorización en tiempo real de las interacciones entre factores de transcripción y ADN en un formato homogéneo basado en solución.
- Valor operativo: Compatible con formatos de placas de pocillos múltiples, lo que permite el cribado de mediana escala de bibliotecas de compuestos.
- Preparación del ensayo: Genera señales de anisotropía de fluorescencia que se correlacionan directamente con las fracciones de ADN unido frente a libre.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Apoya estudios mecanicistas de vías de regulación génica relevantes para modelos de enfermedades.
- Alineamiento de Biomarcadores: Puede adaptarse para evaluar la actividad de factores de transcripción en contextos celulares relevantes para enfermedades.
- Reducción de Riesgos Preclínicos: Proporciona datos cuantitativos de unión para orientar estudios de interacción con el blanco in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento que va desde la validación de la hipótesis del blanco hasta el desarrollo del ensayo y la optimización del fármaco líder, particularmente para blancos que implican la regulación transcripcional.
- Biología del Descubrimiento: Valida la unión entre factores de transcripción y ADN como un mecanismo farmacológicamente abordable y aclara la especificidad del sitio de unión.
- Selección: Permite el desarrollo de ensayos basados en anisotropía de fluorescencia para la selección de moléculas pequeñas o péptidos que interrumpan las interacciones proteína-ADN.
- Análisis: Proporciona constantes de disociación y concentraciones de proteína activa a partir de curvas de titulación, lo que permite la comparación cuantitativa de condiciones de unión.
- Investigación Traducional: Conecta los datos de unión in vitro con la actividad transcripcional celular cuando se combinan con lecturas funcionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma biofísica reutilizable para caracterizar diversos factores de transcripción y secuencias de ADN en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la función de los factores de transcripción mediante mediciones directas y cuantitativas de unión.
- Valor operativo: Proporciona datos reproducibles en fase acuosa con consumo mínimo de muestra y sin artefactos por inmovilización.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al ofrecer datos tempranos sobre afinidad y especificidad para los objetivos transcripcionales.
- Impacto en la cartera: Permite el avance ajustado al riesgo de compuestos basado en la interacción con el objetivo validada a nivel de unión al ADN.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y ensayos de interacción proteína-ácido nucleico.
- Depende del acceso a instrumentación de anisotropía de fluorescencia de alto rendimiento y preparación de muestras basada en geles.
- Necesita un diseño cuidadoso de oligonucleótidos de ADN marcados y competidores para asegurar la especificidad.
- Implica la optimización de la concentración del factor de transcripción y de las condiciones de incubación para lograr un equilibrio en la unión.
- Se limita a factores de transcripción solubles y dianas de ADN accesibles; puede no reflejar los estados cromatinizados in vivo.
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Última actualización: 29 agosto 2026