Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 5:00 min. • July 8th, 2025
El factor de transcripción, TF, es una proteína que se une a la región específica del ADN de un gen y regula la transcripción.
Para medir las interacciones TF-ADN por anisotropía de fluorescencia, tome una placa de pocillos múltiples. Agregue gel fundido mezclado con una solución tamponada, que contenga concentraciones conocidas de ADN de referencia marcado con fluoróforo que comprende un sitio de unión a TF y una mayor concentración de moléculas de TF, al pocillo e incube.
A medida que el ADN de referencia marcado se distribuye en el gel, una mayor concentración de moléculas de TF garantiza que todas las moléculas de ADN estén unidas a TF. Agregue una solución tamponada que contenga ADN competidor no marcado con una mutación de un solo punto.
Analice el gel de la placa mediante microscopía de anisotropía de fluorescencia de alto rendimiento.
La luz polarizada excita el fluoróforo de referencia unido al ADN, que se reorienta debido a la caída molecular y emite luz despolarizada multidireccional, un fenómeno llamado anisotropía de fluorescencia, FA.
Al unirse a TF, el peso molecular del fluoróforo unido al ADN de referencia aumenta y cae más lentamente, emitiendo más luz polarizada
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