JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:25 min • July 8th, 2025
proteínas de unión al ARN, RBP, funcionan como reguladores postranscripcionales al unirse a la región de inicio de la traducción, TIR, del ARNm y reprimir la traducción.
Para estudiar las interacciones ARN-RBP a través de la represión traduccional de un gen reportero, tome un cultivo de células bacterianas que contenga dos plásmidos: el sitio de unión y los plásmidos RBP.
El plásmido del sitio de unión codifica un gen indicador fluorescente. Tras la transcripción, el TIR del ARNm resultante contiene un sitio de unión al ribosoma y una estructura de horquilla, con una secuencia reconocida por las RBP.
Los ribosomas se unen al sitio de unión en el ARNm y desestabilizan la estructura de la horquilla, lo que lleva a la traducción del ARNm y a la formación de proteínas reporteras fluorescentes. El plásmido RBP expresa un RBP quimérico fusionado con una proteína fluorescente diferente. Un promotor inducible controla la expresión de la proteína quimérica.
Agregue el inductor, que activa un factor de transcripción que se une al promotor, induciendo la expresión de proteínas quiméricas. El RBP de la proteína quimérica se une a la estructura de horquilla. Esto impide que el ribosoma se una al ARNm, inhibiendo la traducción de la proteína reportera.
Con el aumento de la concentración del inductor, aumenta la producción de RBP, lo que resulta en una inhibición competitiva más fuerte de la unión ribosómica al ARNm.
Mida las diferentes señales de fluorescencia de las proteínas quiméricas e indicadoras. Trazar las señales, obteniendo la curva dosis-respuesta.
Con el aumento mediado por inductores en la producción de RBP, la represión traduccional reduce la concentración de proteína reportera, lo que confirma la interacción ARN-RBP.
Transformar los plásmidos preparados en células bacterianas químicamente competentes que ya contienen un plásmido RBP-mCerulean. Para ahorrar tiempo, coloque las células con una pipeta de 8 canales en placas de 8 carriles que contengan agar Luria-Bertani con antibióticos relevantes. Las colonias deben aparecer en 16 horas a 37 grados centígrados.
Seleccione una sola colonia para cada doble transformador y transfiérala a placas de 48 pocillos que contengan 1,5 mililitros de LB con los antibióticos adecuados. Cultive las células durante un período de 18 horas a 37 grados centígrados agitando a 250 RPM. Almacene las existencias de glicerol de las noches a -80 grados centígrados en placas de 96 pocillos.
Por la mañana, programe el robot para calentar 180 microlitros de medio semipobre, o SPM, en placas de 96 pocillos. Programe el robot para preparar la placa inductora.
En una placa limpia de 96 pocillos, prepare los pocillos con SPM que consisten en 95% BA y 5% LB. El número de pocillos corresponde al número deseado de concentraciones de inductores. Agregue C4-HSL a los pocillos en la placa inductora que contendrán la concentración de inductor más alta.
A continuación, programe el robot para diluir en serie el medio de cada uno de los pozos de mayor concentración en 23 concentraciones más bajas que van de 0 a 218 nanomolares. El volumen de cada dilución del inductor debe ser suficiente para todas las cepas.
Para diluir las cepas nocturnas, programe el robot para que se diluya en un factor de 10 mezclando 20 microlitros de bacterias con 180 microlitros de SPM en placas de 48 pocillos. Luego, diluya nuevamente en un factor de 10 tomando 20 microlitros de la solución diluida en la placa de tensión preparada previamente adecuada para mediciones fluorescentes.
Ahora, programe el robot para agregar el inductor diluido de la placa inductora a las placas de 96 pocillos con las deformaciones diluidas de acuerdo con las concentraciones finales. Agite las placas de 96 pocillos a 37 grados centígrados durante 6 horas. Durante ese tiempo, tome medidas de la densidad óptica o OD a 595 nanómetros, así como de la fluorescencia mCherry y mCerulean a través de un lector de placas cada 30 minutos.