Ensayo de represión de genes reporteros para estudiar la regulación traslacional de un gen diana

Las

proteínas de unión al ARN, RBP, funcionan como reguladores postranscripcionales al unirse a la región de inicio de la traducción, TIR, del ARNm y reprimir la traducción.

Para estudiar las interacciones ARN-RBP a través de la represión traduccional de un gen reportero, tome un cultivo de células bacterianas que contenga dos plásmidos: el sitio de unión y los plásmidos RBP.

El plásmido del sitio de unión codifica un gen indicador fluorescente. Tras la transcripción, el TIR del ARNm resultante contiene un sitio de unión al ribosoma y una estructura de horquilla, con una secuencia reconocida por las RBP.

Los ribosomas se unen al sitio de unión en el ARNm y desestabilizan la estructura de la horquilla, lo que lleva a la traducción del ARNm y a la formación de proteínas reporteras fluorescentes. El plásmido RBP expresa un RBP quimérico fusionado con una proteína fluorescente diferente. Un promotor inducible controla la expresión de la proteína quimérica.

Agregue el inductor, que activa un factor de transcripción que se une al promotor, induciendo la expresión de proteínas quiméricas. El RBP de la proteína quimérica se une a la estructura de horquilla. Esto impide que el ribosoma se u