Medición de la actividad helicasa de una proteína diana utilizando dúplex de ARN marcados con biotina

Las proteínas con actividad helicasa de ARN pueden ayudar a desenrollar y separar moléculas de ARN individuales en un dúplex de ARN.

Para determinar la actividad helicasa de una proteína, tome tubos que contengan una mezcla de dúplex de ARN marcados con biotina con un saliente de 5', ATP y trampas de ARN, hebras no marcadas complementarias a las hebras biotiniladas de los dúplex.

Agregue la proteína con actividad helicasa a cada tubo e incube durante diferentes duraciones. La proteína se une al saliente 5' de los dúplex.

Usando moléculas de ATP, rompe los enlaces de hidrógeno entre dos hebras dúplex, lo que resulta en su desenrollado y liberación del ARN monocatenario biotinilado. Las trampas de ARN interactúan con las hebras marcadas con biotina, evitando el recocido con las hebras separadas.

Termine la reacción usando un búfer de terminación.

Cargue las muestras en diferentes pocillos de un gel de poliacrilamida nativo. Ejecute electroforesis. El ARN monocatenario de bajo peso molecular se mueve más rápido que los dúplex de alto peso molecular. Este cambio de movilidad genera dos bandas distintas.

Seque el gel en una membrana de nailon, transfiriendo los ARN a la membrana. Después de la transferencia, exponga la membrana a la luz ultravioleta, reticulando los ARN en la membrana.

Agregue estreptavidina conjugada con enzimas quimioluminiscentes, que interactúa con la biotina en los dúplex y hebras monocatenarias. Utilice sustratos quimioluminiscentes para producir productos de quimioluminiscencia.

Tras la obtención de imágenes, la intensidad de la banda de bajo peso molecular aumenta con el tiempo, correlacionándose con la actividad helicasa de la proteína diana.

Para el ensayo de actividad de la helicasa MOV10, mezcle los reactivos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y agregue agua para obtener un volumen de reacción final de 20 microlitros. Incube la reacción a 37 grados Celsius durante 10 minutos, 30 minutos y 60 minutos, y luego, agregue 5X Stop Buffer para detener la reacción. Luego, prepare un gel de poliacrilamida nativa al 20% y cargue de 20 a 25 microlitros de cada muestra en cada pocillo. Deje correr el gel a 100 voltios en un baño de hielo hasta que el marcador azul de bromofenol haya migrado al cuarto inferior del gel.

La acrilamida es dañina y tóxica. Es importante manipularlo con el equipo de protección personal adecuado.

Desmonte las placas de gel y recorte el gel quitando los pozos de carga y los carriles no utilizados. Coloque el gel en tampón TBE 0.5X. Corte el papel de filtro y la membrana de nailon al tamaño del gel, humedezca previamente el papel y la membrana y ensamble la pila para transferirla.

Transfiera las muestras del gel a la membrana en un aparato electroforético semiseco a 90 miliamperios durante 20 minutos. Luego, reticular las muestras irradiando la membrana a 120 milijulios por centímetro cuadrado durante 45 a 60 segundos.

Para la detección de quimioluminiscencia, comience agregando 20 mililitros de tampón de bloqueo a la membrana e incubándolo durante 15 a 30 minutos mientras agita suavemente. Retire con cuidado el tampón de bloqueo y reemplácelo con un tampón de bloqueo conjugado. Incube la membrana nuevamente durante 15 minutos.

Lave la membrana cuatro veces mientras agita durante 5 minutos por lavado. Luego, agregue 30 mililitros de tampón de equilibrio de sustrato a la membrana e incube durante 5 minutos mientras agita a 20 a 25 RPM.

Cubra toda la superficie de la membrana con una solución de trabajo de sustrato e incube durante 5 minutos. Después de la incubación, escanee la membrana en un sistema de imágenes quimioluminiscentes durante 1 a 3 segundos.