Medición de la actividad helicasa de una proteína diana utilizando dúplex de ARN marcados con biotina

Las proteínas con actividad helicasa de ARN pueden ayudar a desenrollar y separar moléculas de ARN individuales en un dúplex de ARN.

Para determinar la actividad helicasa de una proteína, tome tubos que contengan una mezcla de dúplex de ARN marcados con biotina con un saliente de 5', ATP y trampas de ARN, hebras no marcadas complementarias a las hebras biotiniladas de los dúplex.

Agregue la proteína con actividad helicasa a cada tubo e incube durante diferentes duraciones. La proteína se une al saliente 5' de los dúplex.

Usando moléculas de ATP, rompe los enlaces de hidrógeno entre dos hebras dúplex, lo que resulta en su desenrollado y liberación del ARN monocatenario biotinilado. Las trampas de ARN interactúan con las hebras marcadas con biotina, evitando el recocido con las hebras separadas.

Termine la reacción usando un búfer de terminación.

Cargue las muestras en diferentes pocillos de un gel de poliacrilamida nativo. Ejecute electroforesis. El ARN monocatenario de bajo peso molecular se mueve más rápido que los dúplex de alto peso molecular. Este cambio de movilidad genera dos bandas distintas.

Seque el gel en una membrana de nailon, transfiriendo los ARN a la membrana. Despué