Citometría de flujo cuantitativa para estudiar las interacciones proteína-vesículas de fosfolípidos marcadas

Las interacciones proteína-fosfolípido en la membrana celular son cruciales para la regulación de varios procesos celulares.

Para detectar interacciones proteína-fosfolípidos diana in vitro mediante citometría de flujo cuantitativa, tome un tubo que contenga una concentración deseada de imitador de la membrana celular (vesículas de fosfolípidos marcadas con colorante lipofílico de tamaño micrométrico) en tampón.

Agregue una concentración adecuada de diferentes proteínas diana marcadas con fluorescencia en solución.

Inyecte la suspensión en el citómetro de flujo. Establezca los parámetros del sistema de fluidos en un caudal bajo para permitir tiempo suficiente para las interacciones proteína-fosfolípido.

A medida que las proteínas marcadas con fluorescencia y las vesículas de fosfolípidos interactúan en el canal de flujo, aumenta la concentración de proteínas unidas a las vesículas.

A medida que estos complejos pasan a través de los rayos láser desde canales de fluorescencia específicos que proporcionan longitudes de onda adecuadas, se excitan. Estas proteínas excitadas y vesículas de fosfolípidos en el complejo emiten señales de fluorescencia respectivas al relajarse al estado fundamental, que son capturadas por los detectores apropiados.

La detección de una alta intensidad de fluorescencia media de las proteínas es indicativa de la unión de proteínas a las vesículas fosfolípidas.

Comience los experimentos de unión cinética diluyendo vesículas de fosfolípidos en el tampón de Tyrode a una concentración de 1 micromolar y un volumen total de 250 microlitros. Luego, mezcle el factor de coagulación X marcado con fluorescencia o fX-fd a una concentración de 500 nanomolares con las vesículas de fosfolípidos en una proporción de 1: 1 para obtener un volumen total de 500 microlitros.

Inyecte inmediatamente 500 microlitros de la suspensión mezclada en el citómetro de flujo a un caudal con una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y un filtro de emisión de 585 nanómetros con un ancho de 42 para el canal FL2.

A continuación, mida la fluorescencia media en el canal FL4 con excitación a 633 nanómetros y filtro de emisión a 660 nanómetros con un ancho de 20. Cuando se logre la saturación de unión, diluya rápidamente la muestra 20 veces con el tampón de Tyrode y controle la disociación hasta que se alcance una fluorescencia de referencia o una meseta.