JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:36 min • July 8th, 2025
Para estudiar la interacción entre una proteína de unión a fosfolípidos y una bicapa lipídica a través de microgravimetría disipativa, tome una microbalanza con un sensor de cuarzo. Al aplicar un voltaje adecuado, la capa de cuarzo, intercalada entre dos electrodos metálicos, oscila a una frecuencia específica.
Agregue una suspensión de pequeñas vesículas unilamelares, que consisten en una sola bicapa lipídica, en el sensor. Las vesículas se adsorben en la superficie hidrófila recubierta de sílice, aumentando la masa del sensor y disminuyendo proporcionalmente su frecuencia de oscilación.
Las vesículas llenas de tampón actúan como una capa viscoelástica, lo que conduce a la disipación, la amortiguación de la oscilación. Las vesículas adsorbidas se rompen, liberando el tampón cerrado. La disminución resultante de la masa aumenta la frecuencia de oscilación.
Las vesículas rotas forman una bicapa continua, imitando una membrana biológica. La rigidez de la bicapa disminuye la disipación.
Agregue un tampón que contenga iones de calcio, junto con la proteína objetivo. Los iones de calcio se unen a la proteína y cambian su conformación, lo que permite la unión a las moléculas lipídicas en la bicapa.
La unión a proteínas aumenta la masa del sensor, lo que lleva a una disminución de la frecuencia. La integridad estructural de la bicapa no se ve afectada, lo que provoca solo un ligero aumento en la disipación.
Agregue un agente quelante para quelar los iones de calcio, disociando las proteínas de la bicapa.
La ausencia de proteínas unidas devuelve la frecuencia y la disipación de la oscilación a los niveles no unidos a proteínas, lo que confirma que la unión depende únicamente del calcio y que la bicapa permanece intacta.
Acople con cuidado los sensores limpiados con plasma en las cuatro cámaras de flujo con pinzas. Evite cualquier presión o torsión de las cámaras y tubos que puedan causar fugas. Enjuague el sistema con tampón de citrato en el modo de flujo abierto durante 10 minutos.
Inicie el programa. Comience a registrar cualquier cambio en la frecuencia y la disipación del primer tono fundamental y los armónicos utilizando el software hasta que las líneas de base de frecuencia y disipación sean estables.
Cuando las líneas de base sean estables, aplique la suspensión del SUV en el amortiguador de citrato. Usando un recipiente de reacción, elimine 1,5 mililitros del volumen muerto. Luego, cierre el sistema en el modo de flujo de bucle. Registre el cambio de disipación de frecuencia durante otros 10 minutos.
Cuando el SLB sea estable, equilibre el sistema con el tampón en funcionamiento a las concentraciones de calcio requeridas en un modo de flujo abierto durante 40 minutos. Agregue la proteína al tampón de funcionamiento que contiene calcio. Realice la aplicación de la proteína en un modo de flujo de bucle hasta que se alcance un estado estacionario de equilibrio.